考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度

实验报告

学院：第二临床医学院 专业：临床医学 年级：2013级 班级：1班 姓名： 学号： 日期：2014,3,8 得分： 实验课程：生物化学实验

实验名称：蛋白质的定量测定（五）——考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度

【实验目的】

掌握考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量的原理和方法。 【实验原理】

考马斯亮蓝G-250（Coomassie G-250）是一种甲基取代的三苯基甲烷，分子中磺酸基的蓝色染料，在465nm处有最大吸收值。考马斯亮蓝G-250能与蛋白质通过范得华相互作用形成蛋白质—考马斯亮蓝复合物蓝色溶液，引起该染料的最大吸收λmax的位置发生红移，在595nm处有最大吸收值。由于蛋白质—考马斯亮蓝复合物在595n处的光吸收远高于考马斯亮蓝在465nm处的光吸收，因此可大大地提高蛋白质的测定灵敏度。蛋白质—考马斯亮蓝复合物溶液颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。利用溶液颜色的差异进行比色测定，适合于蛋白质类的定量分析尤其适合于稀有蛋白质的微量分析。考马斯亮蓝G-250试剂呈色反应颜色稳定、灵敏度高，最低测试蛋白质量在1ug左右。 【试剂与器材】 试剂：

考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G-250溶于50ml95%乙醇，加入100ml质量浓度为0.85g/ml的磷酸，用蒸馏水稀释到1000ml。

标准蛋白质溶液：结晶牛血清清蛋白，预先经微量凯氏定氮法标定该蛋白质的百分含量，然后根据该蛋白的纯度用0.15mol/LNacl配制成1.0mg/ml蛋白溶液。 器材：

试管和试管架

722型分光光度计 吸量管 移液枪

【实验步骤】

一、 制作标准曲线 管号 标准蛋白质溶液/ml 0.9%Nacl溶液/ml 考马斯亮蓝实剂/ml 各管混匀后，静置3min，以0号管为空白管调零，在595nm波长下分别测定各管溶液的吸光度值（A595）. 以A595值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。 二、 待测蛋白质浓度测定

测定方法同上，1ml待测蛋白质家5ml考马斯亮蓝试剂，。用上述0号管调零，测出血清的A595值。

【实验结果】

管号

0 1 2 3 4 5 6 吸光度值 0.156 0.197 0.262 0.292 0.319 0.362 0.119 5 5 5 5 5 5 5 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 0 0 1 0.2 2 0.4 3 0.6 4 0.8 5 1.0 6 0

由仪器测量可得A595=0.179，可得标准蛋白质溶液为0.0790mg/ml.

【注意事项】

必须在试剂加入后的5~20min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。 测定中蛋白-染料复合物会有少部分吸附在比色杯壁上，测定完后可用乙醇将比色杯清洗干净。

【思考与讨论】

一、考马斯亮兰法的突出优点是：

（1）因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。

（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。

（3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+、离子Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。 二、此法的缺点是：

（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。

（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH（如同0.1N的酸干扰Lowary法一样）

（3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。

三、试验时应当注意分光光度计、吸量管、移液枪的正确使用。