荧光定量PCR实验指南

起始模板的量对于获得高产量很重要。对大多数PCR扩增和荧光PCR扩增，104到106个起始目的分子就足以观测到好的荧光曲线（或在溴化乙锭染色胶上观察到）。所需的最佳模板量取决于基因组的大小（下表）。举例说，100ng到1μg的人类基因组DNA，相当于3×104到3×105个分子，足以检测到单拷贝基因的PCR产物。质粒DNA比较小，因此加入到PCR中的DNA的量是pg级的。对于一般的检测样品，10－100ng的量就足够检测了。当然对模板做一个梯度稀释，对于定量PCR而言是非常容易，且能分析扩增效率。 表1. 基因组大小和分子数目的比例 基因组 DNA E. coli Saccharomyces cerevisiae Arabidopsis thaliana Drosophila melanogaster Homo sapiens Xenopus laevis 1.0Mus musculus Zea mays pUC 18 plasmid DNA Target Size(bp)* Molecules/μg Genomic DNA 4.7×106 2.0×107 7.0×107 1.6×108 2.8×109 2.9×109 3.3×109 1.5×1010 2.69×103 1.8×108 4.5×107 1.3×107 6.6×105 3.2×105 3.1×105 2.7×105 6.0×104 3.4×1011 Amount of DNA(μg) of for -10^5 Molecules 0.001 0.01 0.01 0.5 1.0 1.0 1.0 2.0 1×10-6 3.8 防止残余（Carry-over）污染 PCR易受污染的影响，因为它是一种敏感的扩增技术。小量的外源DNA污染可以与目的模板一块被扩增。当前一次扩增产物用来进行新的扩增反应时，会发生共同来源的污染。这称之为残余污染。从其他样品中纯化的DNA或克隆的DNA也会是污染源（非残余污染）。 可以在PCR过程中使用良好的实验步骤减少残余污染。使用带滤芯的移液管可以阻止气雾剂进入eppendorf管内。为PCR样品配制和扩增后分析设计隔离的区域，在准备新反应前更换手套。总是使用不含有模板的阴性对照检测污染。

使用预先混合的反应成分，而不是每个反应的每个试剂单独加入。 一种防止残余污染的方法是使用尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG）。这种酶（也称为尿嘧啶-N-糖基化酶或UNG）移除DNA中的尿嘧啶。在扩增过程中将脱氧尿嘧啶替换为胸腺嘧啶使得可以把前面的扩增产物同模板DNA区分开来。因为前面的扩增产物对UDG敏感，所有可以在PCR前对新配制的反应用UDG处理以破坏残余产物。 第二部分

1、 高产量，特异和灵活的定量PCR试剂体系

影响PCR的因素如此之多，您有时很难区分是什么导致您的实验结果不佳。降低实验的不稳定因素是使用优质可靠的产品。

使用优质、性能可靠的热启动酶、优质的dNTP、Mg离子、UNG/dUTP防污染系统预混成的定量PCR试剂体系，最大程度的降低了反应变量，提高了实验的可重复性和可靠性。您还需要进行以下步骤的准备：设计引物和探针、合成引物和探针、正确储藏、得到高质量的模板，随后，您仅需要进行退火温度的优化，就能得到好的实验结果。

FQ PCR MASTER Mix-UDG（hot start）同竞争对手的定量PCR体系相比提供了更优异的结果。使用这种产品，您可以在您的PCR中得到更好特异性和更高的灵敏度，同时可以

灵活地选择您所喜欢的扩增条件，检测方法和设备。

实时定量PCR是快速增长的PCR方法，它可以精确、可重复地定量起始物质。FQ PCR MASTER Mix-UDG（hot start）是一种方便使用的反应混合液，为定量分析进行了优化。它包含了荧光PCR所必须的成分（如缓冲液，dNTP，聚合酶）。只需加入您的模板，扩增引物和荧光标记探针。您就可以得到实时qPCR所需的特异性和灵活性。 您可以利用成套的hot start Taq酶 kit(A2010A0106)，来配制不含有UNG/dUTP防污染系统的热启动荧光PCR体系。

您也可以选择hot start Taq酶，UNG酶和dNTPS,来配制含有UNG/dUTP防污染系统的热启动荧光PCR体系。

您可以从实验角度得到多种选择，得到高产量、特异和灵活的定量PCR试剂体系！ 高产量和特异性的扩增

FQ PCR MASTER Mix-UDG（hot start）提供了强大的PCR扩增，可以使用多个模板组。所使用的Taq DNA聚合酶具有热启动特性。这极大地降低和消除了错误配对和非特异性扩增，使您得到较高产量，并增加特异性。整合的UDG（尿苷酸DNA糖基化酶）防止残余污染的能力防止了非模板DNA的扩增，从而降低了假阳性，使结果更可靠。

在产量和灵敏度方面，Quantitative PCR MASTER Mix-UDG（hot start）的灵敏度极高（阈循环）。您可以更精确地定量低拷贝的基因，并在较宽的目的浓度范围内检测线性剂量反应。 高度灵活性

除了灵敏度和特异性外，Universal PCR Master Mix Kit在分析设置，检测方法和设备上给您提供了较高的自由度。使用Universal PCR Master Mix Kit，您可以：

对扩增的不同模板优化镁离子浓度，由于提供了附加的氯化镁，所以您可以方便地配置Mix体系。

可以更灵活的进行普通PCR和荧光PCR。 可以在多种设备上使用，如ABI Prism? 7700, ABI GeneAmp? 5700和Bio-Rad的I-Cycler。 可以利用多种检测方法的优点，包括TaqMan?探针和Molecular Beacon，您不必局限于特定的试剂盒。

您还可以灵活的选择进行自配荧光PCR体系，不论是含UNG/dUTP防污染系统还是不含该系统的。

2、 反应体系配制：

A2010A0101 试剂盒：（探针体系）

FQ-PCR MasterMix-UNG混合物(2X) 25ul（终浓度为1×）；

上游引物（终浓度为50~900nM）（可先设200 nM），下游引物（终浓度为50~900nM）（可先设200 nM）；探针（终浓度为200nM）；待检样品 5ul（终浓度为10~100ng）； 无菌去离子水 补足，使总体积达到 50ul 。

您可以选择荧光染料SYBGREEN体系，具体请参照说明书。 您可灵活使用20-50ul间其他体积，注意保证终浓度相同。 A2010A0106 试剂盒:

反应体系终浓度(自配热启动荧光系统)：

1-2U的hot start Taq酶、3-5.5mM的Mg2+ 、0.2mM的dNTPs、 1×PCR buffer（A2010A0106）；50－900nM 的上游引物（可先设200 nM）、50－900nM 的下游引物（可先设200 nM）、200nM的探针、通常取2-5ul的模板, 无菌去离子水 补足，反应总体积通常为20－50ul

自配热启动荧光－UNG 体系： 1-2U的Taq酶、1×PCR buffer、2.5-4.0mM的Mg2+（A2010A0105 ）；0.2-1U的UNG

酶(A2010A0107)（可先设为0.5U）、0.2mM的d(A,C,G)TPs、0.2-0.4mMdUTP（要调整）(A2010A0108)；50－900nM 的上游引物（可先设200 nM）、50－900nM 的下游引物（可先设200 nM）、200nM的探针、通常取2-5ul的模板、反应总体积通常为20－50ul。 3、反应体系和条件的优化:

使用高产量，特异和灵活的定量PCR试剂体系FQ PCR MASTER Mix-UDG（hot start），优化参数最少。您只需要优化退火温度，就可以得到更灵敏、更可靠的定量结果。对于特殊结构的荧光PCR，您可以优化引物浓度，来得到更特异或更灵敏的结果。

使用通用PCR Master Mix 试剂盒进行反应体系的配制，可以适合更多的反应体系，如mRNA的普通RT-PCR检测，适用于合成质粒的PCR，同时也适用于荧光PCR，范围更宽。

采用成套的hot start Taq酶 kit(A2010A0106)，该试剂盒中含有进行热启动荧光核心试剂盒的所有成分，也降低了选择纯度不够或不合适产品的风险。您需要根据以下原则进行优化： 1、您需要对酶量和镁离子浓度进行优化。酶的推荐反应浓度为1.25－1.5 U（50ul），必要时可在1-2U之间探讨酶的最佳条件；Mg离子推荐浓度普通PCR终浓度为1－3 mM, 荧光PCR终浓度为3－5.5 mM，请在该范围内探讨最佳条件。

2、试剂盒中提供的dNTP已经预混，能够充分保证产品质量和PCR的忠实性。dNTP选择经典的0.2mM的浓度即可。

3、另外，上游引物和下游引物浓度可先设为200 nM。当结果不理想时，可以在50nM－900nM之间进行探讨。

4、 如选用Taqman探针，探针浓度可设为200 nM，不须探讨。选择其他种类的探针需根据要求设置探针浓度。

5、可以先用推荐的反应条件，如果结果不佳，可根据引物、探针设计的具体情况适合的退火温度，退火时间和循环数。

6、DNA模板的添加量通常在100 ng以下，因不同种类的DNA模板中含有的靶基因的拷贝数不同，必要时可进行梯度稀释，确定最佳的DNA模板添加量。如果欲进行2 Step RT-PCR反应的第二步PCR扩增反应，第一步的RT反应液作为DNA模板时的添加量不要超过PCR反应液总体积的10%。

7、稀释所有探针、引物或配制模板请使用无菌双蒸水或Tris溶液。所有反应容器应保证无菌无酶无热源。如进行RNA反应应采用无RNA降解酶的水和容器进行操作。 如采用hot start Taq酶来配制与A2010A0101相同的热启动荧光体系（含UNG/dUTP防污染体系），您可以选择A2010A0105，A2010A0107和A2010A0108进行。与A2010A0106不同的是除了以上的优化步骤外，还增加了对UNG/dUTP系统进行探讨。建议先使用A2010A0106优化好产品体系后，再来优化该防污染系统。

0.2-1U的UNG酶(A2010A0107)（可先设为0.5U）、0.2mM的d(A,C,G)TPs、0.2-0.4mMdUTP (A2010A0108)。反应条件如酶量、Mg离子等都已经调好（参照A2010A0106）,您可以固定d(A,C,G)TPs的浓度为0.2mM，并设定UNG浓度为0.5U(50ul)，dUTP浓度也设为0.2mM，初步来看反应结果。如结果不理想可调整dUTP浓度（上调）。直至得到满意结果。并可进行防污染能力测试（用含U的扩增片断进行）。

请参照3：影响PCR及荧光PCR 的其他因素进行优化。总之，优化的指标越多，实验的不确定性就越大。避免在操作中引入更大的不确定性和不可重复性。可参照的QPCR MASTER Mix-UDG（hot start）使用注意事项。 4、适用的荧光仪器、实验设计、荧光曲线和数据分析；

目前市场上有许多种实时PCR仪：其中包括ABI7700，ABI7900，ABI7000 (Applied Biosystems)；MX4000 (Stratagene)；iCycler (Bio-Rad)；Smartcycler(Cepheid)；Robocycler

(MJ Research)；Lightcycler (Roche)；ROTORGENE(CORBERT) ；杭州博日（Linegene）。 不同的仪器使用方法有所区别，但都具备对Taqman 探针和sybgreen 染料法的检测波长和检测能力。QPCR MASTER Mix-UDG（hot start）和通用PCR Master Mix均适合在这些仪器上进行使用。

为确保实验数据的有效性，每次实验都设阴性对照和4个标准品，每个样品都平行做2个复孔。

基线或阀值的设定 通常是以10－15个循环的荧光值作为阀值，也可以以阴性对照荧光值的最高点作为基线。 问 题 可能原因 建议解决方法 定量PCR DNA模板质量不提高模板质量，诸如DMSO，SDS和甲酰胺之类的试剂会抑无扩增产量好，含有抑制剂 制Taq DNA聚合酶。如果怀疑污染了抑制剂，可以使用乙或很少的扩醇沉淀DNA 增产量 PCR引物设计较避免在引物3'端含有互补序列。避免可以形成内部发卡结差 探针设计较差 构的序列。设计Tm类似的引物。 对探针序列进行blast比对，设计符合要求的探针 PCR引物合成较用普通电泳法，看引物的设计和合成质量，是否有目的条差 带出现。 荧光探针无功能 确保探针设计的有效性和fluorophore和quencher的存在。 用DNase处理TaqMan探针，校验荧光是否增强。 必要的话设计和合成探针。 模板浓度太低 使用10^4拷贝的靶序列，以在25到30个循环中获得信号。 镁离子浓度太低 从3mM到5mM，间隔0.5mM进行一系列反应，确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。FQ-PCR MasterMix-UNG 试剂盒不需优化镁离子浓度。 引物浓度太低 最佳引物浓度介于0.1μM到0.5μM之间。为了精确确定引物浓度，在260nm测量光密度，然后使用光吸收值和消光系数计算浓度。（见公式1） 选择优质酶进行选择hot start Taq酶进行扩增，可提高灵敏度，增加产扩增 量，降低干扰因素 退火温度太高 使用表4的公式估算Tm，把退火温度设定为低于Tm 5℃。因为这些公式只是估算Tm值，所有真正的退火温度实际会高些或低些。 反应物中有不明在各个反应物中存在不明物质对PCR进行干扰，对任何实物干扰 验样品或试剂，均应采用无菌无酶无热源的离心管进行试剂的分装和使用。 定量PCR阳引物、探针设计反应成分是否漏加；确定反应条件是否合适； 性对照无扩合格；原来合成正常标本是否能扩增来判断是对照的问题还是体系的问增曲线（针质量已经验证。题； 对：已经优需确认： 确认体系：1、引物是否降解（看扩增产物是否可电泳出）化好的体来判断引物和酶功能；2、探针是否降解（用DNase处理系） TaqMan探针，校验荧光是否增强）。