常用分子生物学技术及基因诊断练习题

3．简述逆转录 PCR 、原位 PCR 和实时 PCR 技术的基本原理和主要区别。 4. 简述基因诊断的概念及特点。

5. 何为基因治疗，目前基因治疗有哪些基本策略？ 6. 试述基因治疗的基本程序。

7. 欲生产一种药用多肽，科学家已经将此多肽的基因与某真核表达质粒重组在一起。请你 设计一个实验，利用 PCR 方法鉴定此重组表达质粒是否含有这一多肽的基因。 8. 请为某一单基因遗传病（低表达或不表达）的患者设计一个基因治疗方案。 参考答案 一、选择题 （一） A 型题

1.E 2.B 3.D 4.B 5.A 6.D 7.A 8.D 9.B 10.C 11.D 12.A （二） B 型题

1 .D 2 ．B 3 ．C 4 ．E 5 ．B 6 ．C 7 ．A 8 ．D 9 ．D 10 ．B 11 ．C （三） X 型题

1 ． ABCD 2 ．ABCDE 3 ．ABCDE 4 ．ABCDE 5 ．ABC 6 ．ABDE 7 ． BCDE 8 ． BD 9 ． ABCD 10 ． ACD 二、是非题

1 ．× 2 ．× 3 ．√ 4 ．√ 5 ．×. 6. √ 7. × 8. √ 9. × 10. × 三、填空题 1 ．变性 复性

2 ．变性 单链 毛细作用 NC

3 ．电泳 转移 杂交 放射自显影或化学显色 4 ． DNA 重组质粒 噬菌体

5 ． mRNA 差 特异性强 假阳性率低

6 ．特异性蛋白质的存在 特异性蛋白质的半定量分析 蛋白质分子 7 ．变性 退火 延伸 8．功能克隆 定位克隆 9．体细胞 生殖细胞 10病毒载体 非病毒载体 四、名词解释

12 ．E 1 ．探针，是指带有特殊可检测标记（放射性核素或其它化合物标记）的核酸片段，它具有特定的序列，能够与待测的核酸片断互补结合，因此可用于检测核酸样品中特定的基因。 2 ．印迹技术，是指将在凝胶中分离的生物大分子转移或直接放在固定化介质上并加以检测分析的技术。它包括 DNA 印迹技术、 RNA 印迹技术和蛋白质印迹技术等。 3 ．基因文库，是指一个包含了某一生物体全部 DNA 序列的克隆群体。基因文库可以分

为基因组 DNA 文库和 cDNA 文库。

4．基因芯片，又称 DNA 微阵列，包括 DNA 芯片 (DNA chip) 和 cDNA 芯片 (cDNA chip) ，是指将许多特定的 DNA 片段或 cDNA 片段作为探针，有规律地紧密排列固定于支持物上，然后与待测的荧光标记样品进行杂交，杂交后用荧光检测系统等对芯片进行扫描，通过计算机系统对每一位点的荧光信号做出检测、比较和分析，从而迅速得出定性和定量的结果。

5．基因诊断，是指利用现代分子生物学和分子遗传学的技术和方法，直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。

6．基因治疗，从广义上讲，是指将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，以达到治疗疾病目的的方法。

7．基因失活，是指将特定的序列导入细胞后，在转录或翻译水平阻断某些基因的异常表达，已达到治疗疾病的目的。

8．基因置换，是指用正常的基因通过体内基因同源重组，原位替换致病基因，使细胞内的 DNA 完全恢复正常状态。

9．基因增补，是指将目的基因导入病变细胞或其它细胞，不去除异常基因，而通过目的基因的非定点整合，使其表达产物弥补缺陷基因的功能或使原有的功能增强。

10聚合酶链反应，指以 DNA 分子为模板，以一对与模板序列相互补的寡核苷酸片段为引物，在 DNA 聚合酶的作用下，完成新的 DNA 的合成，重复这一过程使目的 DNA 片段得到扩增。这一技术可以将微量目的 DNA 片段扩增一百万倍以上。 五、问答题

1 ．简述印迹技术的分类及应用。

答：印记技术是指将在凝胶中分离的生物大分子转移或直接放在固定化介质上并加以检测分析的技术。它主要包括 DNA 印迹技术 (Southern blot) 、 RNA 印迹技术 (Northern blot) 和蛋白质印迹技术 (Western blot) 等。

DNA 印迹技术主要用于基因组 DNA 的定性和定量分析，例如对基因组中特异基因的定位

及检测等，此外亦可用于分析重组质粒和噬菌体。

RNA 印迹技术主要用于检测某一组织或细胞中已知的特异 mRNA 的表达水平，也可以比较不同组织和细胞中的同一基因的表达情况。

蛋白质印迹技术，也叫免疫印迹，用于检测样品中特异性蛋白质的存在、细胞中特异蛋白质的半定量分析以及蛋白质分子的相互作用研究等。 2．简述 PCR 技术的基本原理及应用。

答： PCR 技术类似于 DNA 的体内复制。以 DNA 分子为模板，以一对与模板序列互补的寡核苷酸片段为引物，在 DNA 聚合酶作用下，利用 4 种脱氧核苷酸，完成新的 DNA 的合成，重复这一过程使目的 DNA 片段得到扩增。这一技术可以将微量目的 DNA 片段扩增 100 万倍以上。基本步骤是首先待扩增 DNA? 模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在 DNA 聚合酶作用下得以延伸。这种变性 - 复性 - 延伸的过程就是一个 PCR 循环， PCR 就是在合适条件下的这种循环的不断重复。主要用于目的基因的克隆、基因的体外突变、 DNA 和 RNA 的的微量分析、 DNA 序列测定和基因突变分析等。 3 简述逆转录 PCR 、原位 PCR 和实时 PCR 技术的基本原理和主要区别。

答：逆转录 PCR 是将 RNA 的逆转录和 PCR 反应联合应用的一种技术。即首先以 RNA 为模板，在逆转录酶的作用下合成 cDNA ，再以后者为模板通过 PCR 反应来扩增目的基因。

原位 PCR 是在固定液固定、石蜡包埋的组织切片或细胞涂片上的单个细胞内进行的 PCR 反应，然后用特异性探针进行原位杂交，即可检出待测 DNA 或 RNA 是否在该组织或细胞中存在。

实时 PCR 的基本原理是引入了荧光标记分子，并使荧光信号强度与 PCR 产物量成正比，对每一反应时刻的荧光信号进行实时分析，计算出 PCR 产物量。根据动态变化数据，可以精确计算出样品中最初的含量差异。

逆转录 PCR 与传统 PCR 相比，将 RNA 的逆转录和 PCR 反应联合起来，可以对已知序列的 RNA 进行定性及半定量分析。常规 PCR 或 RT-PCR 技术的产物不能在组织细胞中定位原位，因而不能与特定的组织细胞特征表型相联系，原位 PCR 技术可以将目的基因的扩增与定位相结合。实时 PCR 技术与传统 PCR 反应相比，在常规正向和反向引物之间，增加了一特殊引物作为探针。该技术可以通过动态监测反应过程中的产物量，消除了产物堆积对定量分析的干扰。

4简述基因诊断的概念及特点。

答：基因诊断是指利用现代分子生物学和分子遗传学的技术和方法，直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。 基因诊断与其他诊断方法相比，基因诊断的方法特点是：

（ 1 ）针对性强，以基因作为检查材料和探察目标，属于 “ 病因诊断 ” 。

（ 2 ）特异性强，用分子杂交技术选用特定基因序列作为探针，故有很高的特异性。 （ 3 ）灵敏度高，所用技术具有放大效应，故诊断灵敏度高 （ 4 ）适用性强，诊断范围广。

5何为基因治疗，目前基因治疗有哪些基本策略？

答：从广义上讲，是指将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，以达到治疗疾病目的的方法，均谓之基因治疗。

(1) 缺陷基因精确的原位修复 包括对致病基因的突变碱基进行矫正的基因矫正和用正常基因通过重组原位替换致病基因的基因置换。这两种方法是对缺陷基因精确的原位修复，不涉及基因组的任何改变，是最为理想的治疗方法，但技术上目前尚未突破。

(2) 基因增补 是指将目的基因导入病变细胞或其它细胞，不去除异常基因，而通过目的基因的非定点整合，使其表达产物弥补缺陷基因的功能或使原有的功能增强。目前基因治疗多采用此法。

(3) 基因失活 是指将特定的序列导入细胞后，在转录或翻译水平阻断某些基因的异常表达，已达到治疗疾病的目的。

(4) 基因疫苗 主要是指 DNA 疫苗，是第三代疫苗。其将编码外源性抗原的基因插入到真核表达质粒中，直接导入人体内，抗原基因在一定时间内持续表达，不断刺激机体免疫系统，达到治病或防病目的。 6. 试述基因治疗的基本程序。 答：基本程序如下：

(1) 治疗性基因选择 选择对疾病有治疗作用的特定目的基因。 (2) 基因载体的选择 有病毒载体和非病毒载体，常用的是病毒载体。

(3) 靶细胞的选择 基因治疗根据受体细胞种类的不同分为体细胞和生殖细胞的基因治疗，目前进行的基因治疗均是体细胞基因治疗和间接体内疗法。

(4) 基因转移 基因导入人体的方式：间接体内疗法，即在体外将外源基因导入靶细胞内，再将这种基因修饰过的细胞回输病人体内，使带有外源基因的细胞在体内表达相应产物，达

到治疗的目的；直接体内疗法，将外源基因直接导入体内有关的器官组织，使其进入相应细胞进行表达。

7. 欲生产一种药用多肽，科学家已经将此多肽的基因与某真核表达质粒重组在一起。请你设计一个实验，利用 PCR 方法鉴定此重组表达质粒是否含有这一多肽的基因。 答：实验步骤如下：

(1) 利用国际基因文库等信息资源，获得这一多肽的基因序列 (2) 根据多肽的基因序列，设计 PCR 引物 (3) 提取转化菌中的重组表达质粒和空载质粒 (4)PCR 扩增

(5)PCR 扩增产物的鉴定

8请为某一单基因遗传病（低表达或不表达）的患者设计一个基因治疗方案。

答： (1) 基因治疗方法：基因增补是指将目的基因导入病变细胞或其它细胞，不去除异常基因，而通过目的基因的非定点整合，使其表达产物弥补缺陷基因的功能或使原有的功能增强。目前基因治疗多采用此法。

( 2) 基因导入方式：间接体内疗法，即在体外将外源基因导入体细胞内，再将这种基因修饰过的细胞回输病人体内，使带有外源基因的细胞在体内表达相应产物，以达到基因治疗的目的。

(3) 基因治疗步骤：治疗性基因的选择 → 基因载体的选择 → 重组体的构建 → 靶细胞的选择 → 基因转移 → 外源基因表达的筛选 → 回输体内 → 检测疗效 a ．治疗性基因的选择：选择该单基因遗传病的野生型基因作为治疗性基因。 b ．基因载体的选择：选用重组腺病毒相关病毒作为载体 c ．靶细胞的选择：选择该患者的淋巴细胞作为靶细胞