SD大鼠甲苯胺蓝染色步骤

SD大鼠甲苯胺蓝染色步骤

1、甲苯胺蓝染色法鉴定软骨细胞表型

Ⅱ代软骨细胞以2x105／ml的密度接种到铺有多聚赖氨酸盖玻片的24孔细胞培养板中，与 原代培养条件相同，制作细胞爬片，常规培养48h后行甲苯胺蓝染色。 具体操作步骤如下：

(1)倾去培养液，PBS充分漂洗3次，加入10％的中性甲醛常温下固定30min。 (2)倾去10％的中性甲醛，PBS充分漂洗3次，加入70％的乙醇固定30min除去四价铵离子， 以免影响染色。

(3)倾去70％的乙醇溶液，PBS充分漂洗3次，晾干，加入甲苯胺蓝乙醇液(甲苯胺蓝0.2g 溶于30％乙醇100m1)染色_20min。

(4)PBS充分漂洗3次，迅速用无水乙醇再漂洗1次。

(5)取出爬片，干燥后中性树脂封片，电子显微镜下观察、摄片。 2、型胶原免疫细胞化染色法鉴定软骨细胞表型

Ⅱ代软骨细胞以2×105／ml的密度接种到铺有多聚赖氨酸盖玻片的24孔细胞培养板中，与原代培养条件相同，制作细胞爬片，常规培养48h后行免疫细胞化学法染色。实验过程严格遵照免疫细胞化学染色试剂盒说明书进行操作，PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照组。 具体操作步骤如下：

(1)倾去培养液，冰冷的PBS漂洗3x3min，加入4%多聚甲醛1ml室温固定15min。 (2)PBS清洗标本3x3min，每张标本滴加1滴新鲜配制的3％H202，室温下孵育10min。 (3)PBS清洗标本3x3min，每张标本滴加穿膜液0.5m](0.1％timton+o.1M Glycine)冰上孵育 30min。

(4)PBS清洗标本3x3min，每张标本滴加5mg／ml的动物非免疫封闭血清(BSA)0.5ml，室温 下封闭1h。

(5)滴加1：150稀释的兔抗大鼠II型胶原多克隆抗体50ul于封口膜上，使标本与一抗充分 接触，置于湿盒中4℃过夜。PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照组。 (6)PBS清洗标本3x3min，加入二抗工作液，37℃孵育20min。 (7)PBS清洗标本3x3min，每张标本滴加1滴SABC试剂，37℃孵育20min后PBS(pH7．2~7．6) 清洗标本4x5min。

(8)DAB显色：取蒸馏水1ml，加入试剂盒中A、B、C试剂各一滴，混匀后滴加至标本。 室温下显色，显微镜下观察并控制反应时间(约5-30min)。 (9)蒸馏水漂洗，苏木素轻度复染，脱水。

(10)干燥后中性树脂封片，电子显微镜下观察、拍照。

豚鼠关节软骨细胞甲苯胺蓝染色鉴定

将F1代豚鼠关节软骨细胞以1×104／ml的浓度传代至孔底铺有圆形盖玻片的24孔板 中；正常培养，制作细胞爬片，镜下观察细胞状态，取细胞状态及数量适宜(2天左右) 的爬片染色。染色步骤如下：

1取出细胞爬片， 用PBS缓冲液漂洗3次，每次3min，吸弃PBS，每张爬片滴加4％多聚甲醛100 ul，铺满爬片，室温固定3h。

2 PBS漂洗3次，每次3min后吸弃PBS，每张爬片滴加70％的乙醇100 ul室温固定20min。 3 PBS漂洗3次，每次3min后吸弃PBS，晾干后每张爬片滴加0．04％的甲苯胺蓝溶液50 ul，室温下处理20min，无水乙醇迅速漂洗1次，晾干封片，观察拍照记录。

II型胶原免疫组化染色鉴定

取F1代豚鼠关节软骨细胞以1×104／m1的浓度传代到铺圆形盖玻片的24孔板中。 常规培养，制作细胞爬片，每天镜下观察细胞生长情况，2天后取出爬片染色。染色 步骤如下：

1、用PBS缓冲液漂洗3遍，每次3min，吸弃PBS，每张爬片滴加新配制的4％多聚甲醛100ul，室温固定30min。

2、PBS漂洗3次每次3min后吸弃PBS，每张爬片滴加100 ul新配的3％H202，室温下处理10min，以便阻断内源性过氧化物酶的活性。

3、PBS漂洗3次每次3min后吸弃PBS，在爬片上滴加50 ul穿膜液后于冰上处理30min。 4、PBS漂洗3次每次3min后吸弃PBS，在爬片上滴加5mg／ml的血清封闭剂(BSA)100 ul，室温下封闭1h。

5、PBS漂洗3次每次3min后吸弃PBS，在爬片上滴加第一抗体(II型胶原抗体)50 ul，置于湿盒中4℃孵育过夜。

6、PBS漂洗3次每次3min后吸弃PBS，在爬片上滴加50ul即用型第二抗体，室温下处理15min。

7、PBS漂洗3次每次3min后吸弃PBS，在爬片上滴加DAB显色试剂(现配)100 ul，室温下处理5min。

8、PBS漂洗3次每次3min后吸弃PBS，苏木素复染20s，蒸馏水充分清洗。细胞爬片用梯度酒精脱水后干燥，封片，观察拍照。