N 病毒毒力测试实验

至正常出雏日后第3日，统计其未出壳胚数、特异性死亡雏鸡数及有禽脑脊髓炎特异性症状(如头颈震颤或麻痹、运动失调等)的发病雏鸡数，按 Reed-Muench 法计算 EID50。同时设6日龄SPF鸡胚10枚，卵黄囊接种灭菌生理盐水，0.2mL/胚，作对照鸡胚，应至少8枚按时出雏。

1.4.2 NDiV病毒对雏鸡的毒力试验

将毒种稀释至100 EID50，分别通过脑内接种、翅膀刺种和口服的途径接种 1日龄SPF鸡各10只，0.1mL/只，观察28日。每日记录出现AE症状的鸡数（病雏症状有：发育不良，精神不振、易惊，半蹲姿势，重者头颈震颤、运动失调，瘫痪等）。同时设10只SPF鸡对照，分别脑内接种、翅膀刺种和口服的途径接种稀释液0.1mL/只，在同等条件下饲养，观察28日，应不发病。

1.4.3 鸡胚平均死亡时间(MDT)试验

新收获的鸡胚尿囊液用无菌生理盐水10倍倍比稀释后,接种10日龄SPF鸡胚,每个稀释度接种6枚鸡胚,0.2mL/枚,并设生理盐水对照组,35°C孵育7d。定时照胚并记录鸡胚死亡数量和死亡时间,收集尿囊液测定血凝价。使所有鸡胚死亡的最高稀释倍数为病毒的最小致死剂量,MDT是最小致死剂量使鸡胚死亡平均时间,具体计算如下：

Xh死亡胚数x Xh+YH死亡胚数x YH

MDT = ──────────────────── 死亡总胚数 参考文献:

[1] 梁国栋.虫媒病毒研究进展[C].国内外医学科学进展，1999.62- 68.

[2] Gorbalenya A E，Enjuanes L，Ziebuhr J，et al. Nidovirales：evolving the largest RNA virus genome [J] . Virus Res，2006，117：17-37.

[3] 刘渠，林琳，周健明，等.中国国内首次发现 Nam Dinh 病毒[J].病毒学报，2013，29（1）.

[4] Florian Z，Andreas K，Phenix-Lan Q，et al. An Insect Nidovirus Emerging from a Primary Tropical Rainforest [J].mBio，2011，2（3）：1-10.

[5] Phan T N，Maria del C P，Chris L，et al. Discovery of the first insect nidovirus，a missing evolutionary link in the emergence of the largest RNA virus genomes [J].

PLoS P，2011，7（9）：1-18.

[6] Phan T N，Nguyen T T，Komichi M， et al. Emerging viruses associated with acute encephalitis syndrome in vietnam[A]. Scientific conference of the institut pasteur international network：emerging and re-emerging viral infections[C]. National Institute of Hygiene and Epidemiology Hanoi，2006.

[7] Chris Lauber，John Ziebuhr，Sandra Junglen，et al.Mesoniviridae: a proposed new family in the order Nidovirales[J]. Arch Virol，2012，157：1623-1628.

[8]朱小娟. 登革病毒在宿主选择压力下基因组核苷酸变异与毒力的相关研究[D].安徽医科大学,2013.

[9]彭文明,黄如统. 五种虫媒病毒的细胞敏感性观察[J]. 微生物学杂志,2002,02:28-29+64.

[10]李慧锋,李丽,张丽娟,等.2010.基因绝对荧光定量PCR标准曲线的建立。山西农业大学报, 30(4): 332-335.

[11]刘欣玉,俞永新,李茂光,徐宏山,王环宇,梁国栋,贾丽丽,董关木. 我国新分离乙型脑炎病毒株毒力特征研究[J]. 病毒学报,2008,06:427-431.

[12]李凯善. 禽脑脊髓炎病毒YBF02毒株的毒力测定与种子批建立[D].西北农林科技大学,2012.