有机污染物高效液相色谱分析技术-紫外-可见光检测器分析酚类化合物

有机污染物高效液相色谱分析技术-（1）紫外-可见光检测器分析酚类化合物

一、实验目的

1、掌握高效液相色谱分析法中的基本原理（包括分配分离原理、紫外-可见光检测器检测原理）；

2、基本了解高效液相色谱（1200LC）组成结构，硬件操作及掌握化学工作站的开机，关机，参数设定，数据采集及分析的基本操作；

3、了解紫外-可见光检测器的基本原理及其适用范围； 4、掌握高效液相色谱定性、外标定量方法。 二、实验原理

液相色谱法适用于分离低挥发性或非挥发性、热稳定性差的物质。高效液相色谱仪以液体作为流动相，并采用颗粒极细的高效固定相的主色谱分离技术，在基本理论方面与气相色谱没有显著不同，它们之间的重大差别在于作为流动相的液体与气体之间的性质差别。与气相色谱相比，高效液相色谱对样品的适用性强，不受分析对象挥发性和热稳定性的限制，可以弥补气相色谱法的不足。

对于酚类化合物的测定，其基本原理是这样的：先用固相小柱吸附水中酚类化合物，然后用溶剂洗脱，经氮吹气浓缩至一定体积 后，用反相高压液相色谱法分析。在反相色谱柱上以甲醇/（水+乙酸）为流动相把经预处理的酚类化合物分离，用紫外检测器，测定各种酚的峰高或峰面积，以外标法定量。

分配色谱原理：主要基于样品分子在流动相和固定相间的溶解度不同（分配作用）而实现分离的液相色谱分离模式。

1、高效液相色谱的组成结构及各部分作用 （1）四元泵：混合、脱气作用。

四元泵真空脱气机由一个四通道（有四个管状塑料膜）真空箱和一个真空泵构成。打开真空脱气机的电源开关后，控制电路即开启真空泵，真空泵运行使真空箱内产生部分真空。真空度由压力传感测定，根据传感器信号，真空脱气机通过运行或关闭真空泵来维持真空度。 （2）自动进样器 （3）柱温箱：

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（4）UV-VIS检测器

（5）C18色谱柱：分离样品中的各个物质。

流动相——真空在线脱气机——四元比例阀——主动输入阀——泵头——出口单向阀——压力阻尼器（侧压力）——泵头——排液阀——自动进样器（其冷凝水排水管必须高于收集瓶，不能浸在液体里。其下有一控温模块，定量环标配100ul，一般进样量5ul-50ul较好）——柱温箱——紫外监测器（流通池）——荧光检测器（一定要荧光串联在紫外之前，因其流通池耐压20bar，紫外可耐压40bar） 2、工作过程

Agilent 1200 LC液相色谱仪的工作过程：输液泵将流动相（经过在线过滤器）以稳定的流速（或压力）输送至分析体系，在进入色谱柱之前通过自动进样器将样品导入，流动相将样品带入色谱柱，在色谱柱中各组分因在固定相中的分配系数不同而被分离，并依次随流动相流至检测器，检测到的信号送至数据系统记录、处理或保存。 3、紫外-可见光（UV-VIS）检测器

基于Lambert-Beer定律，即被测组分对紫外光或可见光具有吸收，且吸收强度与组分浓度成正比。很多有机分子都具紫外或可见光吸收基团，有较强的紫外或可见光吸收能力，因此UV-VIS检测器既有较高的灵敏度，也有很广泛的应用范围。由于UV-VIS 对环境温度、流速、流动相组成等的变化不是很敏感，所以还能用于梯度淋洗。用UV-VIS检测时，为了得到高的灵敏度，常选择被测物质能产生最大吸收的波长作检测波长。（Agilent 1200 UV-VIS检测波长范围为190nm-600nm） 4、外标法定量

外标法是色谱分析中一种简便的定量方法。当样品中所有组分都得到良好的分离并都能被检测而得到色谱峰时，则可利用外标法定量计算样品中各组分的浓度。其定量的依据是被测物质的量与它在色谱图上的峰面积（或峰高）成正比。数据处理软件（工作站）可以给出包括峰高和峰面积在内的多种色谱数据。一般由被测物所配标准浓度与峰面积做标准曲线，由标准曲线求出被测物浓度。 5、液相色谱分离模式 （1）正相色谱法

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采用极性固定相（如聚乙二醇、氨基与腈基键合相）；流动相为相对非极性的疏水性溶剂（烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。常用于分离中等极性和极性较强的化合物（如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。

（2）反相色谱法

一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。RPC在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个HPLC应用的80%左右。

表1 正相色谱法与反相色谱法比较表

固定相极性 流动相极性 组分洗脱次序

三、仪器及试剂 1、仪器

正相色谱法 高～中 低～中 极性小先洗出

反相色谱法 中～低 中～高 极性大先洗出

Agilent 1200 HPLC（四元泵、自动进样器、柱温箱、 UV-VIS检测器、C18色谱柱（4.6*150mm，5um）)，稳压电源。 2、试剂

色谱级甲醇；Miniport超纯水；含3个酚类化合物的标准样品；实际测试水样（配制） 四、测定方法设置

（1）自动进样器：“Injection with Needle Wash”，进样量10μL； （2）泵参数：流速1mL/min，运行时间11min，甲醇：水=75:25； （3）柱温箱参数设定：柱温箱35℃； （4）VWD检测器参数设定：检测波长220nm； 五、实验步骤 1、准备

（1）根据待测物要求配制多个浓度点标准样品，并对样品做好预处理。标样浓度分别为4ppm，6ppm，8ppm，10ppm，12ppm；

（2）实验前流动相提前配好过滤脱气，并正确置换流动相；

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（3）检查管路是否连接完整、检测器是否正常工作 （4）检查废液瓶是否够用。 2、样品分析

（1）打开HPLC工作站（包括计算机软件和色谱仪），连接检测系统；

（2）有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。冲洗泵，直接在泵的出水口，用针头抽取。冲洗进样阀，需要在manual菜单下，先点击purge，再点击start，冲洗时速度不要超过10ml/min。

（3）配置仪器，打开工作界面，按操作要求赶流动相气泡：首先打开排气阀—按PURGE键进行排气结束后—按STOP键停止—再拧紧排气阀—按PUMP键让泵运行；

（4）打开电脑打开在线工站选择对应的通道，输入实验信息方法、包括采样控制，积分和仪器条件，建立平衡柱子分析方法，保存并运行；

（5）然后点数据采集，先走基线，大约1个小时左右基线基本稳定（就是基本成直线，因为检测器打开后需要一定的稳定时间，检测器基本稳定泵里面的流动相同时也就置换好了），柱子平衡了，就可以进样了。

（6）脱机状态下建立样品分析方法，设置自动进样器方法，设置数据保存文件； （7）运行所设置的序列方法，分析标准样品和实际样品。具体可分为单个进样和序列进样； （8）建立清洗及保存柱子的方法，并在样品分析结束后运行。色谱柱长时间不用，存放时，柱内应充满溶剂，两端封死（乙睛/甲醇适于反相色谱柱，正相色谱柱用相应的有机相）。 （9）所有程序都结束后，关泵、关灯，退出程序，关闭电脑、机器； 3、数据处理

可在脱机状态下处理实验数据

（1）从“View”菜单中，点击“Data analysis”进入数据分析画面；

（2）从“File”菜单选择“Load signal”， 选中您的数据文件名， 则数据被调出；

（3）从“Integration”菜单中选择“Integration Events”选项。选择合适的“Slope sensitivity”，（4）“Peak width”，“Area reject”，“Height reject”；

（5）从“Integration”菜单中选择“Integrate”选项， 则数据被积分； （6）如积分结果不理想，则修改相应的积分参数，直到满意为止。 六、实验数据记录

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