实验二 琼脂糖凝胶电泳

实验二：琼脂糖凝胶电泳

【实验目的】学习和掌握琼脂糖凝胶电泳方法。

【实验要求】1.设计所采用实验方案并独立完成所有实验操作; 2.获得完整实验图谱。 一、实验原理：

琼脂糖是一种线性多糖聚合物，系从红色海藻产物琼脂中提取而来的。经化学修饰成低熔点（LMP）琼脂糖，熔点62—65℃。凝胶的分辨能力同凝胶的类型和浓度有关（表2-1）。

表2—1 琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨DNA片段的能力 凝胶类型及浓度 0.3%琼脂糖 0.7%琼脂糖 1.4%琼脂糖 4.0%聚丙烯酰胺 10.0%聚丙烯酰胺 20.0%聚丙烯酰胺 分离DNA片段的大小范围（bp） 50000—1000 20000—1000 6000—300 1000—100 500—25 50—1 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。

凝胶电泳中，加入溴化乙锭（ethidium bromide, EB）染料（灵敏度可达0.05μg）对核酸分子染色紫外光下检测。由于溴化乙锭分子的插入，在紫外光的照射下，琼脂糖凝胶电泳中DNA的条带便呈现桔黄色的荧光，便于鉴定，可对DNA片段做出鉴定。

二、药品试剂及耗材

1. 50X TAE缓冲液500 ml 2. 琼脂糖 3. 10mg/ml EB

4. λDNA/Hind III markers 5. 薄膜手套，透明胶布

三、实验步骤

（一）制备30ml 0.8％琼脂糖凝胶

1、将50×TAE 稀释成1×TAE，称取0.24g琼脂糖粉末加入30ml 1×TAE中，在微波炉中加热1min至琼脂糖溶解。

2、待溶液冷却至50℃～60℃左右，加入1.5ul EB（10mg/ml）至终浓度0.5ug/ml，充分混匀。

（二）胶板的制备

1、取有机玻璃内槽，洗净，晾干，用透明胶封固玻璃板两头。

2、将冷却到50℃～60℃的琼脂糖胶液，缓缓倒入有机玻璃内槽，胶面平整，避免形成气泡，凝胶厚度为3～5mm之间，插上样品梳。

3、待胶凝固后，除去封带，拔出梳子，放入加有足够1×TAE电泳缓冲液的电泳槽中，缓冲液高出凝胶表面约1mm。 （三）加样

1、制备DNA上样液：取5uL DNA+1 uL 上样缓冲液（即DNA：loading buffer= 5：1）混匀（即离心4000rr/min,20s）。

2、用移液枪小心地将上样液垂直地加入加样孔，并记录点样顺序。每加完一个样品，换一个加样头，加样时应防止碰坏样品孔周围的凝胶面以及穿透凝胶底部，本实验样品孔容量约5 uL。 （四）电泳

1、接通电泳槽与电泳仪的电源（注意正负极），正极为红线，采用80～100V电压。 2、溴酚蓝在凝胶中移出适当距离后切断电泳，取出玻璃板，在紫外灯下观察凝胶。 3、洗净电泳槽和梳子，晾干。 补充：

0.8%的琼脂糖凝胶能很好地分辨1-25kb的片段；0.5% 的琼脂糖凝胶用于分辨较大片段的DNA (20~100kb）；对于小片段的DNA(0.2~2kb) 可用1.5%或更高浓度的凝胶进行分离。

上凝胶加样缓冲液（loading buffer）的功能主要有两个。第一，溴酚蓝和二甲苯酚起到指示的作用，显示电泳的进程，以便我们适时终止电泳；第二，甘油可以加大样品密度，使样品密度大于TAE，从而沉降到点样孔中，防止样品飘出点样孔。