李帅论文10.5.26

前采用同样的方法对另2条雄鱼进行精液的采集，用作对照的新鲜精液。 1.2.3 精液的冷冻保存

分别将四种已预冷的冷冻稀释液与精液以3：1的比例进行混合，并迅速分装到0.5ml的麦管中，每种稀释液装10支，用烧热的镊子进行封口，随后将麦管水平放置在距液氮表面2 cm 处，经过5 min的降温后，迅速投入液氮中，然后装入相应的袋子中，保存在液氮罐内。 1.2.4 卵子的采集与保存

采集卵子前先把用干毛巾将成熟雌鱼包好，并将体表特别是生殖孔附近擦干，然后由前向后对雌鱼的腹部进行适度的挤压，将成熟的卵子挤入干燥的带孔烧杯中，闭光储存待用。 1.2.5 伊红染色检测精子活率

精子活率的检测按吴东等人的方法进行[11]。将20μL的精子悬液与等量0.5% 伊红染液在载玻片上混匀并加盖盖玻片, 1 分钟后在高倍镜下进行检测，计数一个视野内的着色精子和未着色精子，并按以下公式计算出相对精子活率。

精子活率（%）= 未着色精子数/精子总数×100。 相对精子活率（%）= 冻精精子活率/鲜精精子活率×100。 1.2.6 人工授精和孵化

冷冻精液经过半个小时的冷冻保存取出,并迅速在25℃水浴中解冻30秒。人

5

工授精按5×10∶1的精卵比例将精子与卵子混合, 并迅速加入配好的授精液（100 mM NaCl，10 mM Tris），轻轻混匀，再用清水冲洗两次，然后放入小型塑料篮中，在水深0.5米的水泥池中进行孵化。孵化过程中的水温9～12℃，并用循环水泵进行淋水增氧。将4天后达到发眼阶段的卵子视为受精卵，并按以下公式进行受精率的计算。

受精率（%）= 受精卵/卵子总数×100。

相对受精率（%）= 冻精受精率/鲜精受精率×100。 1.2.7 苗种培育

对利用鲜精和第Ⅲ组冻精繁殖的鱼苗进行生长对比试验。试验在同一水泥池中的6个不同网箱中进行，培育水温为11-16℃，定时开动增氧机，每天投喂2-3次，适时进行水质调节和消毒处理。经24天的培育后进行成活率的计数、体重、体长的测定。 1.3 数据分析

用SPSS16.0软件对数据进行统计分析，数据用平均值±SD表示，均数的比较采用One-Way ANOVA 分析法，P > 0.05表示差异不显著。

2 结果与分析

2.1 l 甲醇添加水平对冻精精子活率的影响

将精子悬液与伊红染液进行混合后的镜检结果如表1所示。从统计结果可以看出，隨着甲醇添加水平的提高，冻精的相对精子活率也在提高，但当添加到15%时，精子活率反而明显下降，其中加入10%甲醇的冻精得了最高的精子活率，与其它三个添加水平的冻精都有显著性的差异。 2.2 甲醇添加水平对冻精相对受精率的影响

经过4天的培育，卵子达到发眼期，4个实验组和1个对照组的相对受精率测定结果如表1所示。从结果可以看出，隨着甲醇添加水平的提高，冻精相对受精率也在提高，但当添加到15%时，受精率反而下降，其中加入10%甲醇的冻精得

了最高的相对受精率，但各组之间的差异未达到显著性差异水平。

表1 四种精液稀释液对白斑狗鱼冻精精子活率、受精卵受精率的影响

精液稀释液 相对精子活率（%） 相对受精率（%）

Ⅰ 0.3M葡萄糖+0%甲醇+10%蛋黄+1.79

g/LKCl

Ⅱ0.3M葡萄糖+5%甲醇+10%蛋黄+1.79 g/LKCl

Ⅲ 0.3M蔗糖+10%甲醇+10%蛋黄+1.79 g/LKCl

Ⅳ 0.3M葡萄糖+15%甲醇+10%蛋黄+1.79

g/LKCl

24.18±10.83a 29.76±1.08a 56.93±10.99b 22.06±0.27a

75.37±18.00a 86.09±23.78a 93.94±9.13a 65.22±14.17a,

注：平均值后相同字母表示差异不显著，（P > 0.05）

2.3 10%甲醇稀释液冻精繁殖苗种生长性状

用鲜精和第Ⅲ组冻精繁殖的鱼苗经过24天的饲养，对其成活率、体重和体长的分析结果见表2。从表2可知，加10%甲醇稀释液的白斑狗鱼冻精繁殖的鱼苗与对照组之间在成活率、体重和体长方面基本一致，都没有显著性差异。

表2 白斑狗鱼冻精受精卵孵化出的苗种生长情况

组别

Ⅲ 0.3M葡萄糖+10%甲醇

成活率（%） a

72.83±8.51 a78.00±2.78

体重（g） a

0.33±0.14 a0.27±0.01

体长（cm） a

2.92±0.26 a2.82±0.21

+10%蛋黄+1.79 g/LKCl

对照组

注：平均值后相同字母表示差异不显著，（P > 0.05，n=3）

3 讨论

3.1 白斑狗鱼的精液冷冻保护剂的选择

鱼类精子保存主要有低温、常温和冷冻三种，其中超低温冷冻保存是从上世纪50年代开始的。就目前而言，国内外广泛采用液氮（沸点-196℃）通过超低温使精子的代谢停滞，精子处于假死状态，但其结构却能保持完整，以此来达到长期保存精液的目的。目前，常用的冷冻保护剂主要有二甲亚砜、甲醇、乙二醇和甘油等。近年来大量的研究表明甲醇是一种更为有效的冷冻保护剂，在对四种欧洲鲤科鱼类、大西洋鲑和里海斑鳟精液的研究表明10%甲醇的保护效果都优于5%或10%的DMSO的效果[3,4]。本研究表明甲醇10%的添加效果要显著优于0，5，15%的添加效果，具有与鲜精相似的受精率。

3.2 甲醇添加水平对冻精精子活率和受精率的影响

精子膜是精子最外层的细胞结构, 对于细胞内外环境起着重要的生理屏障作用，也是精子在冷冻保存时最易损伤的部位，其完整性是精子维持正常功能的基本保障[24 ]。精子活率的测定正是基于膜的完整性而进行的一项重要的精液品质评价指标，针对细胞膜完整性的染色剂中以伊红和PI最为常用[78]。

本实验采用伊红进行染色，不但染色后能明显区分死、活精子，而且可以在光学显微镜下进行测定，操作简便、直观[111]。本实验研究结果表明，甲醇10%的添加取得最优的效果，精子活率显著在高于其它三个添加水平，这提示采用10%的添加水平，对白斑狗鱼膜的完整性来说是保护性最强的。

本实验中添加10%甲醇的受精率要比其他几组相对较高，虽然差异未达到显著性差异水平。这个结果与精子活率的检测结果是基本一致的，这也说明精子活率越高，膜的完整性越强，受精率相应地也就越高。 3.3 含10%甲醇稀释液的冻精所繁殖苗种的生长情况

关于鱼类精液冷冻保存技术的研究，除了在对稀释液的配制、降温平衡、冷冻保存方法以及冷冻精液的解冻等过程的进行集中研究外，也对鲤鱼（Cyprinus carpio L.）、斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus）和虹鳟（Oncorhynchus mykiss）等几种主要经济鱼类进行了冻精繁殖苗种在生长、形态及畸形率等方面进行了一些研究[101，102，103]。这几种鱼类的研究结果表明，利用冻精繁殖的鱼苗大这些指标上都没有显著性的差异。本实验结果也表明利用含有0.3M葡萄糖、10%甲醇、10%蛋黄和1.79 g/LKCl的稀释液进行冻存的精液繁殖的苗种在成活率、体重、体长等生长性状方面与利用新鲜精液繁殖的苗种相比都没有显著性的差异。

4 结论

（1）本实验研究结果表明，甲醇作为精液冷冻稀释液，10%浓度的甲醇精液冷冻稀释液在精液冷冻保存方面的效果要优于其他浓度。

（2）不同浓度的甲醇精液冷冻稀释液对受精率无影响，各组之间不存在显著性差异。

（3）用10%甲醇作为保护剂的冻精所繁殖的鱼苗与新鲜精液繁殖的鱼苗在早期培育阶段的成活率没有显著性差异。

（4）在培育的鱼苗生长过程中，10%甲醇作保护剂对其生长性状体长以及体重不造成影响，两组间无显著性差异。

谢 辞

走的最快的总是时间，来不及感叹，大学生活已近尾声，四年多的努力与付出，随着本次论文的完成，将要划下完美的句号。本论文设计在张俊杰老师的悉心指导和严格要求下业已完成，从课题选择到具体的写作过程，论文初稿与定稿无不凝聚着张俊杰老师的心血和汗水，在我的毕业设计期间，张俊杰老师为我提供了种种专业知识上的指导和一些富于创造性的建议，张老师一丝不苟的作风，严谨求实的态度使我深受感动，没有这样的帮助和关怀和熏陶，我不会这么顺利的完成毕业设计。在此向张俊杰老师表示深深的感谢和崇高的敬意！

感谢李胜忠老师，本实验的顺利完成还得益于李胜忠老师的热心指导和大力支持，在此对这位老师说声谢谢。

在临近毕业之际，我还要借此机会向在这四年中给予我诸多教诲和帮助的各位老师表示由衷的谢意，感谢他们四年来的辛勤栽培。不积跬步何以至千里，各位任课老师认真负责，在他们的悉心帮助和支持下，我能够很好的掌握和运用专业知识，并在设计中得以体现，顺利完成毕业论文。同时，在论文写作过程中，我还参考了有关的书籍和论文，在这里一并向有关的作者表示谢意。

我还要感谢同组的各位同学以及我的各位室友，在毕业设计的这段时间里，你们给了我很多的启发，提出了很多宝贵的意见，对于你们帮助和支持，在此我表示深深地感谢！