免疫印迹操作步骤

western blot 超详细步骤 一、蛋白质的样品制备： 一、溶液：

裂解液及蛋白酶抑制剂（每毫升裂解液加20ulcocktail） 二、操作步骤：

1、6孔板置于冰上，细胞经预冷的PBS漂洗3次，每孔加入100μl裂解液，5min后用细胞刮刀刮取细胞，用枪头转移至1.5mlEP管中，编号置于冰上。

2、以上所得的样品用超声细胞破碎仪超声处理，超声时间为3S，间歇时间为10S，重复三次。

3、于4℃离心机（预冷）12000r离心15min，取上清，收集于0.5mlEP管中。 二、蛋白浓度的测定（BCA法测定蛋白浓度） 1.取标准蛋白（2mg/ml）备用。

2.于标准蛋白稀释为2mg/ml 1mg/ml 0.5 mg/ml 0.25 mg/ml 0.125mg/ml 0mg/ml，96孔板中每孔加入10ul，设3个复孔，待测蛋白稀释8倍，每孔加入10ul，设3个复孔，每孔加入BCA工作液（A液：B液=50：1混匀）90ul，37℃温浴30min，酶标仪测出各吸光度值，EXCEL输入数据，绘制标准曲线。测出待测蛋白浓度。测完蛋白含量后，计算含30、50μl蛋白的溶液体积即为上样量。按上样量取出样品至0.5ml的EP管中，加入5×SDS 上样缓冲液至终浓度为1×。后蛋白于95℃煮5min（干湿温箱预热）。样品于-80℃保存。

三、电泳 1.制胶 分离胶: 电泳凝胶浓度 试剂 10% H2O(ml) 4.0 30%丙烯酰胺 3.3

1.5mol/lTris.cl(PH8.8) (ml) 2.5 10%SDS(ml) 0.1

10%AP(ml) 0.1 TEMED(μl) 5 总体积(ml) 10 浓缩胶 试剂 浓度(5%) H2O(ml) 2

30%丙烯酰胺(T: 30%,C: 3%(ml) 0.5 1.0mol/lTris.cl(PH8.8) (ml) 0.5 10%SDS(μl) 40 10%AP(μl) 30 TEMED(μl) 4 总体积(ml) 3

1、玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。

2、 按前面方法配10％分离胶，加入TEMED前混匀，加入TEMED后再次摇匀即可灌胶。灌胶时，可用1ml枪吸取胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层水。

3、 当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了，时间约20min左右。用吸水纸将胶上面水吸干。

4.浓缩胶按前面比例加入，加入TEMED前混匀，加入TEMED后再次摇匀，快速灌胶，可用1ml枪吸取胶沿玻璃放出，约5min后浓缩胶凝固，插梳子时要使梳子保持水平。放入4℃冰箱备用。

2、电泳：

1.配制电泳缓冲液（5×）：Tris 15g+甘氨酸72g+SDS 5g+H2O至1L，稀释为1×. 2..取出胶板，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。加足够的电泳液后开始准备上样。（电泳液至少要漫过内侧的电泳槽,外侧量可只到2/3。）用枪头吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将枪头稍插入孔中缓慢加入样品。

3、加样完毕，于冰上电泳，盖好电泳槽的盖子，（注意电极方向红对红，黑对黑），先以80V电压进行电泳15-20min左右，后调电压至 100V，电泳直至溴酚染料前沿下至凝胶末端处，即停止电泳，时间约1h30min左右（注意观察电泳液是否泄漏）。

四、转膜

（1） 配制转膜缓冲液（5×）：Tris 15g+甘氨酸72g加水定容到1L，稀释为1×，放入4℃预冷。

（2） 将PVDF膜在甲醇中活化。在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、滤纸和浸过的膜。

（3） 将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，在垫子上垫一层加厚滤纸，注意不要有气泡。

（4） 要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板。除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去，要避免把分离胶刮破。小心剥下分离胶盖于滤纸上，轻轻用玻棒擀去气泡。将膜盖于胶上，要盖满整个胶（膜盖下后不可再移动）并除气泡。在膜上盖1张加厚滤纸并除去气泡。最后盖上海绵，合起夹子。整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。

（5）先开启4℃循环冷凝水预冷， 将夹子放入转移槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。电转移时会产热，加冰降温。以250mA转膜3h。

五、丽春红染色

转完膜后用TBST浸润一下，将膜用1×丽春红染液染5min（于脱色摇床上摇）。然后用TBST冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。再以TBST彻底洗去丽春红染液。

六、封闭：

以5%的脱脂牛奶粉溶于TBS-T中，将膜放入封闭液中封闭1h。 七、抗体孵育

1、标记Marker分子量，选择目的蛋白所在范围剪膜，将条带在一抗（参照说明书比例VP16 1：1000， ICP4 1：500）及内参（参照说明书）中孵育，封闭于PE手套中，注意不要有气泡，加入约2ml封闭液，后摇床上4℃过夜。

2.取出一抗及内参中的条带，用TBST在水平摇床中洗脱4次，每次5min。加TBST 10ml于50ml离心管中，加入相应二抗（注意羊抗兔还是羊抗鼠），相应条带放入其中（若为两条则背靠背放置），于摇床中孵育1h。

3.离心管中取出条带，置于TBST中洗脱3次，每次10min。 八、显影

于条带上加化学发光(ECL)（比例为1:1）（放置时间不可过长），显影。