生化绿色荧光蛋白的基因克隆及表达开题报告

【实验方法】 ? 重组质粒的构建

? DH-5α和BL-21感受态细胞的制备 ? 感受态细胞的转化 ? 碱法提质粒 ? 酶切鉴定 ? 琼脂糖凝胶电泳 ? PCR-聚合酶链式反应

? Pet-28a-GFP重组质粒转化到表达菌BL-21 ? 重组绿色荧光蛋白（GFP）的诱导表达

【具体实验步骤】

1. 重组质粒的构建

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重组质粒pET-28a-GFP的构建流程 2. DH-5α 和BL-21感受态细胞的制备

1) 将0~4 ℃保存的DH-5α 和BL-21菌种分别接种在LB液体培养基中37 ℃下250 r/min过夜培养16

h 。

2) 将分别接种过夜菌：LB按1:50的比例接种于2 mL的LB液体培养基中，37 ℃活化培养2～3 h至

OD=0.3～0.5 。

3) 取1.5 mL菌液转入EP管中，置于冰上10 min, 然后于4 ℃下5000 r/min离心5 min。弃上清液，

沉淀加入0.1 mL预冷的0.1 mol/L CaCl2缓和悬菌。冰上放置15-30 min后，4 ℃下5000 r/min离心10 min。

4) 弃上清液，沉淀用0.1 mL预冷的0.1 mol/L CaCl2（含15%甘油）缓和悬菌，放在－20 ℃冰箱内

保存。 3. 感受态细胞的转化

取制备好的感受态细胞100 μl，冰上解冻，均匀悬浮。 2) 加入2 μl酶连产物，轻轻混匀，冰上静置10-30 min。 3) 42 ℃水浴中热击70 sec后，冰上放置2 min。

4) 加入200 μl LB液体培养基，37 ℃，50-100 rpm振荡培养1 h。

5) 取200 μl悬浮细胞涂布在含合适抗生素的LB固体培养基上，用涂布器均匀涂布，平皿正放静置1-2 h后，封口膜封好平皿， 37 ℃培养倒置12-16 h。 4. 碱法提质粒

1）感受态细胞经转化培养后，平皿内有但菌落长出。

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2) 用灭菌吸头挑取单菌落，浸没于2 mL含有抗生素的LB液体培养基中，37 ℃, 180 r/min振荡培养过夜。

3) 取1.5 ml 培养物倒入微量离心管中，用微量离心机于4 ℃、11000 r/min 离心1分钟，吸弃上清。 4) 向离心管中加入150 ?l用冰预冷的溶液Ⅰ，用微量移液器吹打重悬沉淀。

5) 加入200 ?l新配制的溶液 Ⅱ，盖紧管口，快速颠倒离心管5次，冰上放置5分钟。 6) 加入150 ?l用冰预冷的溶液 Ⅲ，轻轻混匀，冰上放置3~5分钟。

7) 用微量离心机于4 ℃、11000 r/min离心5分钟，吸取上清转移到另一离心管。

8) 加等体积氯仿400 ?l抽提，振荡混匀，用微量离心机于4 ℃、11000 rpm离心2分钟，将上清转移到另一离心管中。

9) 吸取上清液300 ?l，向上清中加入2倍体积的无水乙醇，混匀后，于室温放置2分钟；用微量离心机于4 ℃、11000 rpm离心5分钟，弃上清。

10) 用70%乙醇洗涤2次，再次4 ℃、11000 rpm离心5分钟，沉淀于空气中干燥。向已干燥的离心管内加20 ?l超纯水溶解质粒DNA，加入2 ?l 10 mg/ml RNA酶，37 ℃处理1小时后于-20 ℃贮存。 5. 酶切鉴定

1)取提取的质粒8 ?l于另一微量离心管中，加入2 ?l Bam H I和Not I的酶切混合液，轻弹管外混匀反应物。 2) 离心，使溶液聚集在管底部 3) 37 ℃，酶切反应。 6. 琼脂糖凝胶电泳

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1) 称取0.8 g琼脂糖，放入到锥形瓶中，加入100 mL 1×TAE缓冲液，置微波炉或水浴加热至完全融化，冷却至60 ℃左右。

2) 轻缓倒入封好两端和加上梳子的电泳胶板中，静置冷却30分钟以上。

3) 将胶板除去封胶带，加电泳缓冲液至电泳槽中，加液量要使液面没过胶面1-1.5毫米，轻轻拔除梳子。

4) 吸取10 ?l的质粒与2 ?l的上样液混匀，吸取混合液将加入加样孔。 5) 接通电泳槽与电泳仪的电源，设置电泳数据U=100 V, I=30 mA。 6) 当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1-2 cm处，停止电泳。 7) 在凝胶成像分析系统中观察结果。 7. PCR-聚合酶链式反应

1) 将PCR管放置在冰盒上，按如下表格加入PCR反应体系各成分

PCR反应体系 template P1(20 mM) P2(20 mM) dNTPs(10 mM) Taqs(5 U/?l)

各成分的量 0.1 ?l 0.2 ?l 0.2 ?l 0.4 ?l 0.2 ?l

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