最新北大医学部复习资料(精品)CRISPR-cas9基因敲除原理及其应用

PKUSHC of Pharmacy现代生物技术理论与应用课程

CRISPR-cas9基因敲除原理及其应用

什么是CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas9基因编辑技术 ？其原理和技术要点是什么？与RNAi的区别在于何处？举一个应用的例子？ 答：定义：CRISPR/Cas9是最新出现的一种由人工构建RNA指导Cas9核酸酶对靶向基因进行编辑的技术。

原理：在CRISPR/Cas9系统中，CRISPR转录后形成crRNA，crRNA通过碱基配对与tracrRNA结合形成tracrRNA/crRNA复合物，此复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA。而通过人工设计这两种RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA （short guide RNA），Cas9首先与sgRNA结合成复合物，然后通过PAM序列结合并侵入DNA，形成RNA-DNA复合结构，进而对目的DNA双链进行切割，使DNA双链断裂。由于PAM序列结构简单（5’-NGG-3’），几乎可以在所有的基因中找到大量靶点，因此得到广泛的应用。

技术要点： 1. 从已知序列中通过PAM定位寻找合适的靶点并合成gRNA； 2. 构建gRNA与Cas9重组质粒；

3. 对重组质粒进行活性检测，敲除活性的计算；

4. 挑选活性较高的敲除质粒导入细胞或体内进行基因组定点编辑操作； 5. 利用测序、RFLP等方法检测基因组定点修饰结果。 区别：CRISPR/Cas9与RNAi的区别如下表： 靶点/目标 CRISPR/Cas9 1. DNA(调控转录) 2. 阻止转录起始或转录延伸 RNAi 1. RNA(调控翻译) 2. RNA降解 3. 定位于细胞质 1 / 2

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3. 编码基因和非编码基因均可 4. 定位于细胞核 设计/构建 1. 简单灵活 2. 可设计算法 3. PAM限制了其目标序列 敲除效率 1. 易变 2. 脱靶效应(可能较少) 1. 易变 2. 脱靶效应 1. 简单灵活 2. 可设计算法 应用：Rudolf Jaenisch 研究组将Cas9与Te1和Tet2特异的sgRNA共注射到小鼠的受精卵中，成功得到双基因敲除的纯合子小鼠，效率高达80%。他们将Cas9/sgRNA 与带突变序列的引物共注射，能准确在小鼠两个基因引入所要的点突变。在ES细胞中他们更是成功的一次敲除了五个基因。

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