westernblot步骤

蒸馏水至 2000ml

3，G250考马斯亮蓝溶液（测蛋白含量专用）

考马斯亮蓝G250： 100mg

95％乙醇： 50ml

磷酸： 100ml

蒸馏水至 1000ml

配制时，先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料，再加入磷酸和水，混匀后，用滤纸过滤，4℃保存。

4，0.15 mol/L NaCl

NaCl（MW58.44） 0.877g

蒸馏水至 100 ml

高温灭菌后，室温保存。

5，100mg/ml 牛血清白蛋白（BSA）

BSA 0.1g

0.15 mol/L NaCl 1ml

溶解后，－20℃保存。制作蛋白标准曲线时，用0.15 mol/L NaCl进行100倍稀释成1mg/ml，－20℃保存。

6，10％分离胶和4％浓缩校

10％分离胶（两块胶，10ml） 4％浓缩胶（两块胶，5ml）

超纯水 4.85ml 3.16ml

40％Acr/Bic（37.5：1） 2.5ml 0.5ml

1.5 mol/L Tris·HCl（pH8.8） 2.5ml －

0.5 mol/L Tris·HCl（pH6.8） － 1.26ml

10％SDS 100 ml 50 ml

10%AP（过硫酸胺） 50 ml 25 ml

TEMED 5 ml 5 ml

加TEMED后，立即混匀即可灌胶。

7，还原型5XSDS上样缓冲液（0.25mol/L Tris·HCl pH6.8，0.5mol/L二硫叔糖醇，10％ SDS，0.5％溴酚蓝，50％甘油）

0.5 mol/L Tris·HCl（pH6.8） 2.5ml

二硫叔糖醇（DTT，MW154.5） 0.39g

SDS 0.5g

溴酚蓝 0.025

甘油 2.5ml

混匀后，分装于1.5ml离心管中，4℃保存。

8，电泳液缓冲液（25mmol/L Tris，0.25mol/L甘氨酸，0.1％ SDS）

Tris（MW121.14） 3.03g

甘氨酸（MW75.07） 18.77g

SDS 1g

蒸馏水至 1000ml

溶解后室温保存，次溶液可重复使用3～5次。

9．转移缓冲液（48mmol/L Tris，39mmol/L甘氨酸，0.037％ SDS，20％甲醇）

甘氨酸（MW75.07） 2.9g

Tris（MW121.14） 5.8g

SDS 0.37g

甲醇 200ml

蒸馏水至 1000ml

溶解后室温保存，次溶液可重复使用3～5次。

10，10X丽春红染液

丽春红S 2g

三氯乙酸 30g

磺基水杨酸 30g

蒸馏水至 100ml

使用时将其稀释10倍。

11，TBS缓冲液（100mmol/ L Tris·HCl pH7.5,150mmol/L NaCl）

1 mol/ LTris·HCl（pH7.5） 10ml

NaCl 8.8g

蒸馏水至 1000ml

12，TBST缓冲液（含0.05％Tween20的TBS缓冲液）

20％Tween20 1.65ml

TBS 700ml

混匀后即可使用，最好现用现配。

13，封闭液（含5％脱脂奶粉的TBST缓冲液）

脱脂奶粉（国产，安怡牌） 5g

TBST 100ml

溶解后4℃保存。使用时，恢复室温，用量以盖过膜面即可，一次性使用。

14，洗脱抗体缓冲液（100mmol/L 2-Mercaptoethanol，2％SDS，62.5m mol/L Tris·HCl pH6.8）

14.4 mol/L 2- Mercaptoethanol(β-巯基乙醇) 700 ml（通风厨里加）

SDS 2g

0.5mol/L Tris·HCl（pH6.8） 12.5ml

超纯水至 100ml

配制时，在通风厨内进行。4℃保存。可重复使用1次。

15，显影液（5X）

自来水（加热至50℃） 375ml （以下药品加到温水中）

米吐尔 1.55g

亚硫酸钠（无水） 22.5g

碳酸钠（无水） 33.75g

溴化钾 20.95g

补水至 500ml

配制时，上述药品应逐一加入，待一种试剂溶解后，再加入后一种试剂。4℃保存。使用时用自来水稀释至1倍。

16，定影液

自来水（50～60℃） 700ml （以下药品按顺序加入前者溶解后再加后者）

硫代硫酸钠 240g

亚硫酸钠（无水） 15g

冰乙酸 12.6ml

硼酸 7.5g

钾明矾 15g（水温冷至30℃以下时再加入）

加水定容至1000ml，室温保存

17，抗体

用TBST稀释至一定浓度使用，每张膜需0.5ml

18，化学发光试剂

购自北京中山公司，为Santa Cruz产品，分A和B两种试剂。

引自：http://wenshl2005.blog.163.com/blog/static/206897020073230139608/

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