3 广东省仿制药一致性评价生物等效性试验生物样品分析规范（试行）

5.2 样品处理方法的摸索

根据药物理化性质探索生物样品的处理方法，如液-液萃取或蛋白沉淀法等，选择的处理方法应稳定、尽可能减小基质效应并能满足分析需要的定量下限等优点。

6. 分析方法验证方案的制定

分析验证方案应明确实验人员的分工和操作安排，并对其进行版本控制。在验证方案实施前，应对相应实验操作人员进行培训。验证方案修订时应确保实验人员充分了解修订内容。分析验证方案应至少包括项目基本信息、实验人员、标准物质信息、仪器和试剂、分析方法、验证项目、接受标准和结果计算方法等，其中应对特殊情况的处理有明确说明和定义，例如内标响应异常是指同位素标记内标响应值在标准曲线样内标响均值的50%~150%范围外。

7. 分析方法的完整验证

分析方法验证包括专属性，定量下限，线性范围，准确度，精密度，基质效应，提取回收率、生物基质和储备液中分析物和内标的稳定性、稀释因子、系统耐用性等。首次开发和实施的生物分析方法；新的化学实体分析方法；已验证方法追加分析多个分析物（不同药物、母体药物及其代谢产物、药物及其对映体或异构体）。生物分析方法的完整验证（Full Validation）包括以上所有考察项目。

7.1 专属性

该分析方法应该能够区分目标分析物、内标、基质（如全血、血浆、尿）的内源性组分或样品中其他组分（如制剂辅料）。

应该使用至少6个不同来源的适宜的空白正常基质来证明选择性，当干扰组分的响应低于分析物LLOQ响应的20%，并低于内标响应的5%时，即可以接受。

应考察药物代谢物、经预处理生成的分解产物及同用药物的干扰程度。考察同用药物的干扰程度，是向至少6个不同来源的空白基质中添加同用药物至临床可能的最高浓度水平（如Cmax），接受标准同专属性考察的接受标准。在适当情况下，也应该评价代谢物在分析过程中转化为母体分析物的可能性。在新化学实体的早期研究中，代谢产物未被发现，因此很难对该指标进行评价。可在后期的深入试验中获得易发生转化的代谢产物（如易酯化的酸性代谢物、氮氧化物、葡萄糖醛酸化代谢物和内酯环代谢物等），补充部分验证。若代谢物难以获得，可应用已测样品再分析（Incurred Sample Reproducibility）评价代谢产物的回复转化。若无法避免该转化，必须详细报告转化情况和产生的影响。

7.2 携带效应（Carry-over）

应该在方法建立中考察残留并使之最小。应根据药物特性在方法验证方案中设计残留效应考察方法，一般在定量上限（ULOQ）后，进空白样品进行考察。残留的峰面积低于待测物LLOQ响应的20%，并低于内标响应的5%，即可以接受。残留可能不影响准确度和精密度。如果残留看起来不可避免，则应考虑特殊措施，如改变洗针液成分和比例，或在可能的高浓度样品后注射空白样品，然后分析下一个试验样品。

7.3 定量下限

定量下限（LLOQ）是能够被可靠定量的样品中分析物标准曲线的最低浓度，具有可接受的准确度和精密度，至少5个测定样品分析来确定准确度。LLOQ通常为标准曲线的最低点，应适用于预期的浓度水平和试验要求。

7.4 标准曲线

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应该获得仪器对分析物的响应水平，并且应该在适当的浓度范围内进行标准曲线评价。通过加入已知浓度的分析物（和内标）到空白基质中，获得各浓度的标准曲线样进行预处理，其基质应该与目标试验样品基质相同。方法验证中每种分析物和每一分析批，都应该有一条校正曲线。

用于配制标准曲线和质控样品储备液的标准物质应分别称量。二者的准确度应接近。评价标准曲线和质控样品储备液浓度接近程度的参考方法：将标准曲线和质控样品的储备液分别稀释至相当于中浓度质控样品浓度的溶液，加入内标后，连续进样。评价标准为：二者连续进样，各自与内标比值的变异应小于5%；二者的偏差小于5%。若整个试验样品测定过程中多次称量和配制储备液，应分别提供每次称量的上述比较结果。

校正曲线范围应该覆盖预期浓度范围，即LLOQ（标准曲线样的最低浓度）至 ULOQ（定量上限，标准曲线样的最高浓度）的范围。该范围应足够描述分析物的药动学特征。一般建议LLOQ不高于预期血药浓度峰值Cmax的10%，ULOQ应当至少为预期血药浓度峰值Cmax的两倍。应当使用至少6个校正浓度水平，标准曲线应有空白样品(不含分析物和内标的处理过的基质样品）和零浓度样品（含内标的处理过的基质），空白样品和零浓度样品不参与标准曲线的拟合计算。

建议每个分析批采用双标准曲线拟合方式，即标准曲线样平行处理2份。若无特殊原因，每条标准曲线应从低浓度至高浓度依次进样。标准曲线样的计算浓度偏差，LLOQ应在±20%以内，其余应在标示值的±15%以内。应该使用简单且足够描述仪器对分析物浓度响应的方程式，最少6个标准曲线样参与标准曲线的拟合，至少75%的标准曲线样应满足上述标准，如果某个标准曲线样结果不符合这些标准，应该拒绝这一标样，不含这一标样的标准曲线应被重新进行回归分析和评价；两份标准曲线样应同时拟合得到一条标准曲线用于该分析批的定量。一般以待测物峰面积AS和内标峰面积AIS的比值?（?=AS/AIS）为y，待测物浓度为x，取适当的权重（如1/x2）采用加权最小二乘法进行线性回归，拟合标准曲线方程（校正方程），相关系数r的平方（r2）建议不小于0.9900。

在方法验证中，至少应该评价3条标准曲线。最好使用新鲜配制的标准曲线样建立标准曲线，但如果有稳定性数据支持，也可以使用预先配制并储存的标准曲线样。每个标准曲线样可以被多次处理和分析。应该提交标准曲线参数（包括权重、斜率、截距、相关系数r或r2），测定标准曲线样后回算得出的浓度及相应偏差应一并提交。

7.5 准确度

分析方法的准确度描述该方法测得值与分析物真实浓度的接近程度。应采用加入已知量分析物的样品（即QC样品）来评估准确度，并应该根据标准曲线分析QC样品，将计算值与标示值对比，表示为即标示值的百分比，表示为（测得值-真实值）/真实值×l00%，即计算值与标示值的偏差表示。

在方法验证时，应通过至少4个浓度水平，包括LLOQ、LQC、MQC和HQC，每个浓度至少5个测定样品分析来确定准确度。浓度水平应在校正曲线范围内：在LLOQ浓度3倍之内的低浓度QC（LQC），标准曲线的中间浓度 QC（MQC），以及校正曲线范围上限约75%处的高浓度QC（HQC）。应通过单一分析批（批内准确度）和不同分析批(批间准确度)获得质控样品值来评价准确度。

（1）批内准确度

为了验证批内准确度，应取一个分析批的LLOQ、低、中、高浓度QC水平，每个浓度至少用5个样品，每个浓度水平所有样品偏差的均值在±15%之内，LLOQ应在±20%以内。若有质控样品响应异常，应在统计计算中剔除，剔除后该浓度水平的QC样仍应满足至少5个测定值的要求。

（2）批间准确度

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通过至少两个不同天的3个分析批，每批在LLOQ、低、中、高浓度 QC 样品的每个浓度至少5个测定值来评价。计算所有有效分析批的QC样品标示值的偏差应在±15%范围内，LLOQ应在标示值的±20%范围内。

报告的准确度和精密度的验证数据应该包括所有获得的测定结果，但是已经记录明显失误的情况除外。

为评价一个分析批中不同时间的任何趋势，应在方法验证阶段确定分析批大小（batch size），建议以不少于一个分析批预期样品数的QC样品数进行批内准确度考察。原则上，未知样品的分析批不应大于方法验证分析批。

7.6 精密度

分析方法的精密度描述分析物重复测定的接近程度。精密度用相对标准差（变异系数，%CV或%RSD）表示。应使用与证明准确度相同分析批样品的结果，获得在同一批内和不同批间LLOQ以及低、中、高浓度QC样的精密度，每个浓度至少5个样品，批内变异系数值不得超过15%，LLOQ不得超过20%。对于验证批间精密度，至少需要两个不同天的3个分析批。

报告的准确度和精密度的验证数据应该包括所有获得的测定结果，但是已经记录明显失误的情况除外。

7.7 基质效应

当使用质谱方法时，应该考察基质效应。使用至少6批来自不同个体的空白基质，不应使用合并的基质，分别在低、中、高浓度下进行。如果基质难以获得，则使用少于6批基质，但应该说明理由。

对于每批基质，应该通过计算基质存在下的峰面积Amx（由空白基质提取后加入分析物和内标测得），与不含基质的相应峰面积的平均值Asol,mean（分析物和内标的纯溶液）比值，分别计算每一分析物和内标的基质因子（Matrix factor，MF）：

MF(%)=Amx/Asol,mean×100%

内标纯溶液的峰面积均值是指所有纯溶液的内标峰面积均值。若低、中、高浓度的变异系数值≤15%，则认为基质效应可以接受。

待测物的基质因子除以内标的基质因子，计算经内标归一化的基质因子（ISnorm-MF）：

MFIS-n(%)=MFdrug/MFIS×100%

MFIS-n的变异系数应≤15%，则认为基质效应可以接受。如果不能适用上述方式，例如采用在线样品预处理的情况，则应该通过分析至少6批基质，分别加入高、中、低浓度待测物来获得批间响应的变异。其验证报告应包括分析物和内标的峰面积，以及每一样品的计算浓度。这些浓度计算值的总体变异系数不得大于15%。

必要时考察待测物在特殊基质中的基质效应，如溶血血浆、高脂血浆等，基质效应考察方法和接受标准与正常基质相同。

7.8 稳定性

稳定性评价是为了确保样品采集、分离、预处理、运输、和检测的每一步骤，以及使用的储存条件，都不影响分析物的精密度和准确度。稳定性评价包括待测物和内标在溶剂、生物基质及预处理等过程中的稳定性考察。文献报道的数据不可以用于证明稳定性，但可以作为稳定性实验设计的参考依据。

7.8.1 溶剂稳定性

待测物和内标在溶剂中的稳定性，指储备液和工作液在储存和使用条件下的稳定性（长期和短期稳定性），以待测物和内标的峰面积比值作为评价指标。如有必要，不同材质的承装容器（如玻璃瓶或聚丙烯离心管）对待测物和内标稳定性的影响也应进行考察。待测物或内标储备液和工作液稳定性考察，采用新鲜配制或稳定期内的待测物或内标溶液作为参比，储备液一

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般要稀释至ULOQ和LLOQ浓度，得到参比溶液的待测物与内标峰面积比值记为?0（AS/AIS）；保存储备液或工作液也参照参比样进行稀释并用新鲜或稳定期内的内标工作液进行预处理，得到的比值记为?x，通常认为?x与?0的偏差在±10%以内时可认为待测物储备液或工作液在该条件下稳定。内标溶剂稳定性的评价则以?'0（?'=1/?0, AIS/AS）为指标，方法与待测物溶剂稳定性考察方法相同，但是选用新鲜或稳定期内的待测物溶液作为参比，得到?'x，通常认为?'x与?'0的偏差在±10%以内可认为内标储备液或工作液在该条件下稳定。可以在方法验证方案中根据待测物或内标的特性制定接受标准。

7.8.2 全血稳定性

应考察待测物在全血中的稳定性，以支持临床全血样本采集、运输和储存条件，应根据实验室的相关SOP或分析验证方案中规定的方法进行考察，建议至少考察全血在室温条件下的稳定性。例如，采用新鲜的空白全血配制成低、中、高质控浓度的全血质控样品。取新鲜空白全血，加入药物工作液配制成低、高浓度的全血质控样品，轻轻反复颠倒混匀，然后置于37℃水浴中孵育，根据药物性质考察孵育时间。检测时将全血质控样品离心后取上层血浆进行预处理和分析，以0时刻（T0）检测浓度值或峰面积比值作为对照，根据方案中规定的偏差范围（如±20%）判断全血在该条件下的稳定性。若使用检测浓度作为评价指标，应至少有两个浓度水平的全血样品检测浓度值在线性范围内，若不足两个浓度水平，则应重新选择全血稳定性考察浓度以满足上述要求。

7.8.3 检测基质稳定性

待测物在检测基质中的稳定性考察，应至少考察以下几种条件：

（1）从冷库储存条件到室温，基质中分析物反复冻融的稳定性：QC 样品解冻后的样品在同样条件下重新冷冻。在每一循环，样品都应被冷冻 12 小时以上，然后解冻。反复冻融稳定性的循环次数一般不少于3次，应等于或超过试验样品的冷冻/融化循环次数。

（2）基质中分析物在室温实验台上的稳定性； （3）基质中分析物储存的长期稳定性；

（4）处理过的样品（如干燥提取物或沉淀上清液）在室温下或试验过程中的稳定性，如果适用；

（5）处理过的样品在自动进样器中的稳定性。 稳定性检查应考察不同储存条件，时间范围应不小于试验样品储存的时间。在多个分析物试验中，应该关注每个分析物在所有分析物基质中的稳定性。

用于稳定性考察的QC样品（简称稳定性样品）应视为未知样品进行检测，即需要随行新鲜或稳定期内的标准曲线和QC样品。根据校正曲线计算稳定性样品的浓度，若计算浓度与标示浓度的偏差应在±15%以内则认为稳定性样品稳定。

7.9 稀释可靠性

若血浆样品浓度高于定量上限时，应采用的空白血浆稀释后重新测定，应预考察稀释数倍的稀释可靠性。每个稀释浓度至少5个测定值。准确度和精密度应在±15%以内。稀释可靠性所选的稀释倍数应该覆盖试验样品所用的稀释倍数。可通过部分方法验证来评价稀释可靠性。需考察稀释样品的批内准确度和精密度。

7.10 提取回收率

配制低、中、高浓度的对照样和生物基质QC样品进行回收率考察。对照样采用基质效应样，QC样品进行预处理，每个浓度平行处理至少5份，进样分析并记录色谱图，对照样中分析物的峰面积记为S，QC样品中药物的峰面积记为C，最后，将上述C和 S代入下式即可分别求得分析物的提取回收率（R%）。内标的提取回收率计算方法与药物相同。

R(%)=C/S×100%

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