分子生物学简答题

9、比较原核生物与真核生物基因组结构的异同，并指出真核生物细胞的RNA内含子剪接的主要方式。

答案要点：主要从重复序列情况，有无内含子外显子方面论述，剪接的主要方式指GU-AG和 AU-AC类内含子的间接以及I、II类内含子的间接方式。

10、比较原核生物与真核生物基因表达调控的异同点。

答案要点：共同点是两者主要是在转录水平进行调控；不同点是原核生物转录与翻译偶联，以操纵子调控的现象普遍；真核生物基因表达复杂，转录和翻译是分开的，转录后从细胞核进入细胞质，调控因此也比较复杂，在DNA水平、转录水平和翻译水平均存在。 1. 基因敲除的基本程序？

1. 答：通过DNA同源重组，使得胚胎干细胞特定的内源基因被破坏而造成功能丧失，然后通过胚胎干细胞介导得到该基因丧失的小鼠模型的过程称为基因敲除。

A、打靶载体的构建：同源序列要足够长，要含有筛选用的标志基因。 B、胚胎干细胞的体外培养 C、打靶载体导入胚胎干细胞 D、同源重组胚胎干细胞的筛选 E、基因敲除胚胎干细胞注射入胚泡 F、胚泡植入假孕小鼠的子宫中 G、杂交育种获得纯合的基因敲除动物 2、DNA芯片的原理？

答：DNA芯片技术就是一种大规模的集成的固相核酸分子杂交，以大量已知碱基序列的寡核苷酸片段为探针，检测样品中哪些核酸序列与其互补，然后通过定性定量分析得出待测样品的基因序列及表达的信息。其方法包括芯片的制备、样品的准备、分子杂交和检测分子。

3、PCR的反应条件？ 答：A、PCR反应的缓冲液： ? Tris-HCl缓冲液

? KCl 促进引物的退火，浓度太高时会抑制Taq DNA聚合酶活性。 ? 加入BSA或明胶有利于保护TaqDNA聚合酶活性。

? 必要时加入适量二甲基亚砜(DMSO)或甲酰胺利于破坏模板二级结构，提高PCR反应特异

B、镁离子浓度 一般用量1.5-2.0 mmol/L，Taq DNA聚合酶活性需要Mg 2+。Mg 2+浓度过低，会显著降低酶活性。Mg 2+浓度过高又使酶催化非特异性扩增增强。Mg 2+浓度还会影响引物的退火、模板与PCR产物的解链温度，从而影响扩增片段的产率。

C、底物浓度 工作浓度20-200umol/L， dNTPs浓度过高可加快反应速度，也增加碱基的错配率和实验成本。降低浓度会导致反应速度下降，可提高反应的特异性。在PCR反应中，4种dNTP必须以等摩尔浓度配制，以减少PCR反应的错配误差并提高使用效率。 D、Taq DNA聚合酶 75-80℃时具有最高的聚合酶活性，150个核苷酸/秒；具有良好的热稳定性，95℃仍有活性，应用浓度一般为1-2.5u/100ul反应体积。

E、引物 0.1-0.5umol/L。引物浓度偏高会引起错配或非特异性扩增、生成引物二聚体，使目的DNA片段产率下降。退火温度与引物Tm值有关，引物Tm值在55-80 ℃ 范围较为理想。 F、反应温度和循环次数

4、分子克隆中常用的工具酶及良好载体的条件？ 答：（1）、常用的工具酶

A、限制性核酸内切酶：是细菌产生的一类能识别和切割双链DNA分子内特定的碱基顺序的核酸水解酶。 B、DNA连接酶：将两段DNA分子拼接起来的酶。 C、DNA聚合酶：催化单核苷酸链延伸。

D、逆转录酶：依赖于RNA的DNA聚合酶，这是一种有效的转录RNA成为DNA的酶，产物DNA又称互补DNA。 E、末端脱氧核糖核酸转移酶：将脱氧核糖核酸加到DNA的3末端。 F、碱性磷酸酶：催化去除DNA、RNA等的5磷酸基团。 G、依赖DNA的RNA聚合酶：识别特异性启动子，RNA转录。 （2）、良好载体的条件 A、必须有自身的复制子；

B、载体分子上必须有限制性核酸内切酶的酶切位点，即多克隆位点，以供外源DNA插入；C、载体应具有可供选择的遗传标志，以区别阳性重组子和阴性重组子； D、载体分子必须有足够的容量；

E、可通过特定的方法导入细胞；

F、对于表达载体还应具备与宿主细胞相适应的启动子、前导顺序、增强子、加尾信号等DNA调控元件。 5、蓝-白筛选的原理？

答：某些质粒带有大肠杆菌的半乳糖苷酶基因片段，在半乳糖苷酶基因的基因区外又另外引入了一段含多种单一限制酶位点的DNA序列。这些位点上如果没有克隆外源性DNA片段，在质粒被导入lac-的大肠杆菌后，质粒携带的半乳糖苷酶基因将正常表达，与大肠 杆菌的半乳糖苷酶基因互补，产生有活性的半乳糖苷酶，加入人工底物X-gal和诱导剂IPTG后，出现蓝色的菌落。如果在多克隆位点上插入外源DNA片段，将使lac Z基因灭活，不能生成半乳糖苷酶，结果菌落出现白色。由于这种颜色标志，重组克隆和非重组克 隆的区分一目了然 7、核酸分子杂交的原理？

答：具有互补序列的两条单链核酸分子在一定的条件下（适宜的温度及离子强度等）碱基互补配对结合，重新形成双链；在这一过程中，核酸分子经历了变性和复性的变化，以及在复性过程中个分子间键的形成和断裂。杂交的双方是待测核酸和已知序列。 8、影响杂交的因素？

答：1、核酸分子的浓度和长度：核酸浓度越大，复性速度越快。探针长度应控制在50-300个碱基对为好。

2、温度：温度过高不利于复性，而温度过低，少数碱基配对形成的局部双链不易解离，适宜的温度是较TM值低25度。

3、离子强度：在低离子强度下，核酸杂交非常缓慢，随着离子强度的增加，杂交反应率增加。高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定，所以进行序列不完全同源的核酸分子杂交时必须维持杂交反应液中的盐浓度和洗膜液中的盐浓度。

4、杂交液中的甲酰胺：甲酰胺能降低核酸杂交的TM值。它有以下优点：在低温下探针更稳定；能更好地保留非共价结合的核酸。 5、核酸分子的复杂性：是指存在于反应体系中的不同顺序的总长度。两个不同基因组DNA变性后的相对杂交速率取决于样品浓度绝对一致时的相对复杂性 9、探针的种类和优缺点？

答；1、cDNA探针：通过逆转录获得cDNA后，将其克隆于适当的克隆载体，通过扩增重组质粒而使cDNA得到大量的扩增。提取质粒后分离纯化作为探针使用。它是目前应用最为广泛的一种探针。

2、基因组探针：从基因组文库里筛选得到一个特定的基因或基因片段的克隆后，大量扩增、纯化，切取插入片段，分离纯化为探针。 3、寡核苷酸探针：根据已知的核酸顺序，采用DNA合成仪合成一定长度的寡核苷酸片段作为探针。 4、RNA探针：采用基因克隆和体外转录的方法可以得到RNA或反义RNA作为探针。 10、探针的标记法？

答：1、缺口平移法：此法是利用适当浓度的DNase Ⅰ在DNA双链上随机切割单链，造成单链切口。切口处产生一个5末端和3末端，3末端就可以作为引物，在大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的催化下，以互补的DNA单链为摸板，依次将dNTP连接到切口的3末端的羟基上，合成新的DNA单链；同时DNA聚合酶Ⅰ的5→3的核酸外切酶活性在切口处将旧链从5末端逐步切除，新合成链不断延伸，从而使原DNA分子上的部分核苷酸残基被标记的核苷酸所取代。

2、随机引物法：随机引物是人工合成的长度为6个寡核苷酸残基的寡聚核苷酸片段的混合物。对于任何一个用作探针的DNA片段，随机引物混合物中都会有一些六核苷酸片段可以与之结合，起到DNA合成引物的作用。将这些引物与变性的DNA单链结合后，以4 种dNTP（其中一种是标记物标记的dNTP）为底物，合成与探针DNA互补的切带有标记物的DNA探针。

3、PCR标记法：在PCR反应底物中，将一种dNTP换成标记物标记的dNTP， 这样标记的dNTP就在PCR反应的同时掺入到新合成的DNA链上。

4、末端标记法：只是将DNA片段的一端进行标记。 11、PCR的基本原理？

、答：PCR是在试管中进行的DNA复制反应，基本原理是依据细胞内DNA半保留复制的机理，以及体外DNA分子于不同温度下双链和单链可以互相转变的性质，人为地控制体外合成系统的温度，以促使双链DNA变成单链，单链DNA与人工合成的引物退火，然 后耐热DNA聚合酶以dNTP为原料使引物沿着单链模板延伸为双链DNA。PCR全过程每一步的转换是通过温度的改变来控制的。需要重复进行DNA模板解链、引物与模板DNA结合、DNA聚合酶催化新生DNA的合成，即高温变性、低温退火、中温延伸3个步骤构 成PCR反应的一个循环，此循环的反复进行，就可使目的DNA得以迅速扩增。DNA模板变性：模板双链DNA?单链DNA，94℃。退火：引物＋单链DNA?杂交链，引物的Tm值。引物的延伸：温度至70 ℃左右， Taq DNA聚合酶以4种dNTP为原料，以目的DNA 为模板，催化以引物3’末端为起点的5’→3’DNA链延伸反应，形成新生DNA链。新合成的引物延伸链经过变性后又可作为下一轮循环反应的模板PCR，就是如此反复循环，使目的DNA得到高效快速扩增。 12、PCR引物设计的基本要求？

答：1、引物长度一般为15～30个核苷酸。过短影响PCR的特异性，过长会提高相应退火温度，使延伸温度超过TaqDNA聚合酶最适温度74℃,影响产物的生成。

2、引物的碱基尽可能随机，避免出现嘌呤、嘧啶碱基堆积现象。3’端不应有连续3个G和C。否则会使引物和模板错误配对。G+C含量一般占45％ -55％。3’端和5’端引物具有相似的Tm值,Tm值计算公式：Tm＝4(G+C)+ 2(A+T)

3、引物自身不应存在互补序列以避免折叠成发夹结构。引物的连续互补序列，一般不超过3bp。 4、两个引物之间不应存在互补序列，尤其应避免3’端的互补重叠。

5、引物与非特异扩增区的序列的同源性不超过70％，引物3’末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。

6、引物3’端碱基是引发延伸的起点，因此一定要与模板DNA配对。引物3’端最佳碱基选择是G和C，形成的碱基配对比较稳定。 7、引物与模板结合时，引物的5’端最多可以游离十几个碱基而不影响PCR反应的进行。

8、引物的5’端可以修饰，如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其它短序列包括起始密码子、终止密码子等。

13.对天然质粒的人工构建主要表现在哪些方面？

答：天然质粒往往存在着缺陷，因而不适合用作基因工程的载体，必须对之进行改造构建： a、加入合适的选择标记基因，如两个以上，易于用作选择,通常是抗生素基因。 b、增加或减少合适的酶切位点，便于重组。

c、缩短长度，切去不必要的片段，提高导入效率，增加装载量。 d、改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝。 e、根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件

14.基因文库的构建对重组子的筛选举出3种方法并简述过程

答：抗生素抗性筛选、抗性的插入失活、兰-白斑筛选 或PCR筛选、差式筛选、DNA探针过程：多数克隆载体均带有抗生素抗性基因（抗氨苄青霉素、四环素）。当质粒转入大肠杆菌中后，该菌便获得抗性，没有转入的不具有抗性。但不能区分是否已重组。在含有两 个抗性基因的载体中，如果外源DNA片段插入其中一个基因并导致该基因失活，就可用两个分别含不同药物的平板对照筛选阳性重组子。如pUC质粒含LacZ基因（编码β半乳糖苷酶）该酶能分解生色底物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)产生蓝色，从而使菌 株变蓝。当外源DNA插入后，LacZ基因不能表达，菌株呈白色 1．参与蛋白质生物合成体系的组分有哪些?它们具有什么功能?

1答．A.mRNA：蛋白质合成的模板；B.tRNA：蛋白质合成的氨基酸运载工具；C.核糖体：蛋白质合成的场所；D.辅助因子：(a)起始因子—--参与蛋白质合成起始复合物形成；(b)延长因子—--肽链的延伸作用；(c)释放因子一--终止肽链合成并从核糖体上释放出来。 2．遗传密码是如何破译的?

答(1)体外翻译系统的建立；(2)核糖体结合技术；(3)核酸的人工合成。 3．遗传密码有什么特点?

答(1)密码无标点：从起始密码始到终止密码止，需连续阅读，不可中断。增加或删除某个核苷酸会发生移码突变。 (2)密码不重叠：组成一个密码的三个核苷酸只代表一个氨基酸，只使用一次，不重叠使用。

(3)密码的简并性：在密码子表中，除Met、Trp各对应一个密码外，其余氨基酸均有两个以上的密码，对保持生物遗传的稳定性具有重要意义。

(4)变偶假说：密码的专一性主要由头两位碱基决定，第三位碱基重要性不大，因此在与反密码子的相互作用中具有一定的灵活性。 (5)通用性及例外：地球上的一切生物都使用同一套遗传密码，但近年来已发现某些个别例外现象，如某些哺乳动物线粒体中的UGA不是终止密码而是色氨酸密码子。

(6)起始密码子AUG，同时也代表Met，终止密码子UAA、UAG、UGA使用频率不同。 4．简述三种RNA在蛋白质生物合成中的作用。

答(1)mRNA：DNA的遗传信息通过转录作用传递给mRNA，mRNA作为蛋白质合成模板，传递遗传信息，指导蛋白质合成。 (2)tRNA：蛋白质合成中氨基酸运载工具，tRNA的反密码子与mRNA上的密码子相互作用，使分子中的遗传信息转换成蛋白质的氨基酸顺序是遗传信息的转换器。

(3)rRNA 核糖体的组分，在形成核糖体的结构和功能上起重要作用，它与核糖体中蛋白质以及其它辅助因子一起提供了翻译过程所需的全部酶活性。

6．氨基酸在蛋白质合成过程中是怎样被活化的?

答催化氨基酸活化的酶称氨酰-tRNA合成酶，形成氨酰-tRNA，反应分两步进行： (1)活化 需Mg2+和Mn2+，由ATP供能，由合成酶催化，生成氨基酸-AMP-酶复合物。

(2)转移 在合成酶催化下将氨基酸从氨基酸—AMP—酶复合物上转移到相应的tRNA上，形成氨酰-tRNA。 7．简述蛋白质生物合成过程。

答蛋白质合成可分四个步骤，以大肠杆菌为例：

(1)氨基酸的活化：游离的氨基酸必须经过活化以获得能量才能参与蛋白质合成，由氨酰-tRNA合成酶催化，消耗1分子ATP，形成氨酰-tRNA。

(2)肽链合成的起始：由起始因子参与，mRNA与30S小亚基、50S大亚基及起始甲酰甲硫氨酰-tRNA(fMet-tRNAt)形成70S起始复合物，

整个过程需GTP水解提供能量。

(3)肽链的延长：起始复合物形成后肽链即开始延长。首先氨酰-tRNA结合到核糖体的A位，然后，由肽酰转移酶催化与P位的起始氨基酸或肽酰基形成肽键，tRNAf或空载tRNA仍留在P位．最后核糖体沿mRNA5’→3’方向移动一个密码子距离，A位上的延长一个氨基酸单位的肽酰-tRNA转移到P位，全部过程需延伸因子EF-Tu、EF-Ts，能量由GTP提供。 (4)肽链合成终止，当核糖体移至终止密码UAA、UAG或UGA时，终止因子RF-

1、RF-2识别终止密码，并使肽酰转移酶活性转为水解作用，将P位肽酰-tRNA水解，释放肽链，合成终止。 8．蛋白质合成中如何保证其翻译的正确性?

答：(1)氨基酸与tRNA的专一结合，保证了tRNA携带正确的氨基酸；

(2)携带氨基酸的tRNA对mRNA的识别，mRNA上的密码子与tRNA上的反密码子的相互识别，保证了遗传信息准确无误地转译； (3)起始因子及延长因子的作用，起始因子保证了只有起始氨酰-tRNA能进入核糖体P位与起始密码子结合，延伸因子的高度专一性，保证了起始tRNA携带的fMet不进入肽链内部；

(4)核糖体三位点模型的E位与A位的相互影响，可以防止不正确的氨酰-tRNA进入A位，从而提高翻译的正确性；

(5)校正作用：氨酰-tRNA合成酶和tRNA的校正作用；对占据核糖体A位的氨酰-tRNA的校对；变异校对即基因内校对与基因间校对等多种校正作用可以保证翻译的正确。

9．原核细胞和真核细胞在合成蛋白质的起始过程有什么区别。 答1)起始因子不同：原核为IF-1，IF-2，IF-2，真核起始因子达十几种。 (2)起始氨酰-tRNA不同：原核为fMet-tRNAf，真核Met-tRNAi

(3)核糖体不同：原核为70S核粒体，可分为30S和50S两种亚基，真核为80S核糖体，分40S和60S两种亚基 10．蛋白质合成后的加工修饰有哪些内容?

答：(1)水解修饰；(2)肽键中氨基酸残基侧链的修饰；(3)二硫键的形成；(4)辅基的连接及亚基的聚合。 12．真核细胞与原核细胞核糖体组成有什么不同?如何证明核糖体是蛋白质的合成场所? 答原核细胞：70S核糖体由30S和50S两个亚基组成；

真核细胞：80S核糖体由40S和60S两个亚基组成。利用放射性同位素标记法，通过核糖体的分离证明之。 15.原核生物与真核生物的翻译比较如下：仅述真核生物的，原核生物与此相反。 （1）.起始Met不需甲酰化；

（2）.无SD序列，但需要一个扫描过程； （3）.tRNA先于mRNA与核糖体小亚基结合； （4）.起始因子比较多； （5）.只一个终止释放因子。 简述转录的基本过程?

答案要点： 转录的基本过程包括：模板的识别；转录起始；通过启动子；转录的延伸和终止。。 2.简述原核和真核细胞在蛋白质翻译过程中的差异. 答案要点：1、起始因子不同； 3、翻译过程（肽链延伸）因子不同； 4、终止因子不同

3试比较原核和真核细胞的mRNA的异同.

答案要点：A.真核生物5‘端有帽子结构大部分成熟没mRNA 还同时具有3’多聚A尾巴，原核一般没有； B.原核的没mRNA 可以编码几个多肽真核只能编码一个。

C.原核生物以AUG作为起始密码有时以GUG，UUG作为起始密码，真核几乎永远以AUG作为起始密码。 D.原核生物mRNA半衰期短，真核长。E.原核生物以多顺反子的形式存在，真核以单顺反子形式存在。 4.分别说出5种以上RNA的功能？ 转运RNA tRNA 转运氨基酸

核蛋白体RNA rRNA 核蛋白体组成成 信使RNA mRNA 蛋白质合成模板 不均一核RNA hnRNA 成熟mRNA的前体 小核RNA snRNA 参与hnRNA的剪接

小胞浆RNA scRNA/7SL-RNA 蛋白质内质网定位合成的信号识别体的组成成分 反义RNA anRNA/micRNA 对基因的表达起调节作用 核 酶 Ribozyme RNA 有酶活性的RNA

6简述tRNA的二级结构特征并指明作用与作用机制。

答案要点：1. tRNA携带AA，是一种酶促反应，也称AA的活化

2、氨基酰是tRNA 是AA参与蛋白合成的活化形式。 AA的活化：氨基酸+ATP-E 氨基酸-AMP-E+PPi

3、每活化一分子AA需消耗ATP的2个高能磷酸键。 AA的转移：氨基酸+ AMP-E+ tRNA 氨基酸-tRNA+AMP+E

4、氨基酰tRNA合成酶是高度专一性，既能高度特异性识别AA，又能高度特异性识别相应，这两点是保证翻译准确进行的基本条件之一。

5.氨基酰AMP-E复合体：作为中间产物，利于酶分别对AA和tRNA两种底物特异辨认，如有错配，合成酶有校正活性，水解磷酸酯键，与正确底物结合 7. 增强子的作用特点

答案要点：①增强子提高同一条DNA链上基因转录效率，可以远距离作用(1－4kb、30kb)，在基因的上游或下游都能起作用。 ②增强子作用与其序列的正反方向无关。

③增强子与启动子在结构、功能上密切联系，要有启动子才能发挥作用,但对启动子没有严格的专一性，同一增强子可以影响不同类型启动子的转录。

④增强子的作用机理虽然还不明确，但必须与特定的蛋白质因结合后才能发挥增强转录的作用。增强子一般具有组织或细胞特异性，是由这些细胞或组织中具有的特异性蛋白质因子所决定的。 8. 列举一个已知的DNA序列编码一种以上蛋白质的三种方法。

答案： 给定的一段DNA序列可以以下述方式编码两种或两种以上的蛋白质： (1)可读框中在核糖体结合位点之后含有多重起始位点； (2)以一两个碱基的移码方式出现重叠的可读框；

(3)不同的剪接方式，例如，选择不同的外显子组合成不同的mRNA。 15.列举4种天然存在的具有催化活性的RNA。 答： I型内含子、II型内含子、RnaseP、锤头型核酶。 19.哪三个序列对原核生物mRNA的精确转录是必不可少的?

答： -35(RNA聚合酶结合位点)、-10(RNA荣合酶起始位点)启动子序列和终止子； 22.(1)如何区分由启动子起始转录的RNA片段与5’端被加工过的RNA片段；

答： (1)转录中，5’核苷三磷酸聚合到RNA链的3’-0H端，这过程包括释放焦磷酸（即两个磷酸基)和形成磷酸二酯键。因此，只有5’端第一个核苷酸会有三磷酸基团。若RNA被加工，则5’端的核苷酸会被取代，剩下核苷单磷酸末端。