实验四麦清蛋白的初步提取

实验四 麦清蛋白的初步提取

生物112 周泓兆 1102040226

一、研究背景及目的

无论是在科学研究还是商业化产品的开发中，生物大分子的分离纯化似乎都是开发所需要的。随着人们对某一特定目标产物活性与纯度的需求逐渐增大，人们努力寻找目标物的自身特性，不断探索新的技术以提高纯化水平。

在所有的分离纯化技术中，层析技术以其独特的优势始终占据着生物大分子纯化的主导地位。层析法是利用不同物质理化性质的差异而建立起来的技术，从本质上来讲它就是将目标分离产物与杂质的显著差异转化为迁移距离上的差异，从而达到分离提取的目的。层析法具有明显的优势：（1）从理论上来讲，只要迁移距离足够长，任何物质都可以从其所在的混合体系中被分离出来；（2）除了定性能力较差以外，层析法几乎囊括了物质分析纯化中的所有优点，比如分离效率高、速度快，样品用量少、检测灵敏度高、分析速度快、易于自动化管理等；（3）基于不同的原理，层析法衍生出诸多的操作技术，在实际应用中可以根据待分离物质的特定性质选择适合的操作技术；（4）可以尽可能地保护目标物不受损坏，保持其活性。基于以上原因，层析法在分离高纯度、高活性的生物大分子中有着不可替代的作用。

因此我们希望通过本次试验以验证该技术完成麦清蛋白的脱盐的可行性，掌握层析技术的基本操作方法，并且体会相关技术的发明思路和历程，领悟新技术的发明对边缘性实验学科的重要作用。

二、原理

凝胶过滤层析是生化分离常用色谱技术的一种，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用,根据被分离物质的分子大小不同来进行分离，也被称为体积排阻层析、分子筛层析。

凝胶是一类多孔性高分子聚合物，每个颗粒犹如一个筛子。当样品溶液通过凝胶柱时，相对分子质量较大的物质沿着凝胶颗粒间的孔隙，随着溶剂流动，首先流出层析柱；相对分子质量较小的物质可自由地进出凝胶颗粒的网孔，使流量增长，移动速率慢而最后流出层析柱；中等大小的分子在大分子物质与小分子物质之间被洗脱。这样，由于分子量大小不同的物质被洗脱的时间是一定的，经过层析柱后，混合物中的各物质按其分子大小不同而被分离。

在凝胶过滤层析中，选择适宜的凝胶是取得良好分离效果最根本的保证。蛋白样品的脱盐或蛋白、核酸溶液去除小分子杂质以及一些注射剂去除大分子热源物质等等，一般常用排阻极限较小的凝胶类型。选择时要依据分离的具体情况而定，例如样品中各个组分差别较大，则可以选用大颗粒的凝胶，这样可以很快的达到分离的目的；如果有个别组分差别较小，则要考虑使用小颗粒凝胶以提高分辨率。

实验选取麦清蛋白为纯化对象进行研究，首先通过盐析法对小麦种子提取液中的麦清蛋白做粗提取，得到麦清蛋白与硫酸铵的混合物，然后通过凝胶过滤层析除盐，最后利用紫外分光光度计测定各阶段纯化产物的OD280以检测蛋白含量，同时用BaCl2检测纯化产物中有无硫酸根离子从而鉴定纯化效果与确定硫酸铵被洗脱出来的时间。

三、仪器与试剂

1. 仪器：仪器：UV9600紫外分光光度计（北京瑞利分析仪器公司）、TDL-40B低速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）、JP-100架盘药物天平（常熟市双杰测试仪器厂）、HL-2恒流泵（上海沪西分析仪器厂）、BSZ-100自动部分收集器（上海沪西分析仪器厂）、层析柱（上

海锦华层析设备厂）、SL-200型高速多功能粉碎机（浙江省永康市松青五金厂）、微量可调手动移液器（大龙）、小烧杯、研钵、试管，离心管，三角瓶，滴管，滤纸。 2. .试剂：饱和硫酸铵，1%氯化钡。 3材料：新鲜小麦种子，葡聚糖凝胶G-25。

四、实验方法/操作步骤

1. 溶胀凝胶（教师完成）：称取葡聚糖凝胶G-25适量，加入足量的蒸馏水或洗脱液于沸水浴中溶胀5h。溶胀平衡后，适度搅拌使充分悬浮后稍静置，待大部分凝胶沉降后，除去含有细碎颗粒的上层液，如此反复操作多次直至无细微颗粒为止。最后将漂洗好的凝胶在真空干燥器中减压除气。

2. 装柱：打开层析柱柱帽，下端止水，装入1/4左右柱长的磷酸盐洗脱液（防止装柱不匀）。将凝胶边搅拌边倒入柱中，同时开启洗脱，使凝胶一直处在溶液中，一次性连续装柱直至柱长的3/4-4/5左右，若高度不够，则趁凝胶还未完全沉降的时候再加入适量凝胶。装柱完成后适时止水以使洗脱液面高于凝胶面3~5cm（若液面过低则用胶头滴管延管壁缓缓加入缓冲液至高于凝胶面3~5cm，尽量减少对凝胶上表面的扰动），待凝胶沉降完成后，旋上柱帽，连接洗脱系统，重力洗脱约3h。

3. 盐析法分离提取麦清蛋白：取粉碎后的小麦种子，称取2g于研钵中研磨成细粉状，转移至三角瓶中，加入20ml蒸馏水，连续震荡0.5h，再间歇震荡0.5h后，在3000rpm的条件下离心20min，取上清液，在不断搅拌的条件下滴加等体积的饱和硫酸铵溶液，冰箱冷藏4小时左右。盐析充分后在3000rpm的条件下离心20min，弃去上清液，加2ml去离子水充分溶解沉淀，即得麦清蛋白与硫酸铵混合液，准备上样脱盐。

4. 上样：打开柱帽，放入略小于层析柱内径的滤纸片，使其自然飘落在凝胶面上。连接收集系统，确定流速（6滴/min），准备上样。利用恒流泵加速按钮使洗脱液面与胶床表面相切甚至相齐时，停止洗脱。用加样器取1.5ml样品提取液，小心滴入凝胶床面中央，然后开启洗脱，同时开启收集器。待样品与凝胶面相齐时，迅速用滴管加入略高于上样高度的洗脱液，如此重复两次。待洗脱液再次与凝胶面相齐时，用滴管小心加入3~5ml高洗脱液层，旋上柱帽，连续洗脱收集。

5. 洗脱、收集和鉴定：每3毫升收集一管，对其分别编号，然后用紫外分光光度计测量每管的OD280并记录。以管号为横坐标，消光值为纵坐标，绘制洗脱曲线。比色完毕后，各管分别加2滴1%的BaCl2溶液（峰值管除外），震荡混匀观察是否产生白色沉淀并记录。

五、数据整理

实现数据记录如下： 管号 1 2 0.013 无 11 0.055 无 3 0.012 无 12 0.040 无 4 0.012 无 13 0.052 有 5 0.012 无 14 0.067 有 6 0.010 无 15 0.054 有 7 0.108 无 16 0.038 有 8 1.148 无 17 0.028 无 9 0.787 无 18 OD280 0.018 沉淀 管号 无 10 OD280 0.150 沉淀 无 六、结果计算与讨论分析

根据上表的数据，以管号为横坐标、OD280为纵坐标，绘制洗脱曲线如下：

洗脱曲线1.41.21吸光值0.80.60.40.2002468管号1012141618

由图可见，蛋白质被收集在了7-10号管中，其中7号和10号管中麦清蛋白含量较低，8号管中麦清蛋白含量最高，达到峰值。而14号管吸光度小幅升高，可能是实验过程中混入了可以吸收紫外线的杂质或是比色皿未完全清洗干净导致。 根据各管滴加BaCl2后产生沉淀的情况可绘制出下表：

沉淀1有无沉淀0012345678910管号111213141516171819

由图可见，硫酸铵被收集在了14-17号管中。可见麦清蛋白与硫酸铵的分离效果明显，说明此技术可以成功地达到蛋白质除盐的目的。

七、结论与展望

从实验结果中我们可以看出，凝胶过滤层析可以很好地对大分子物质及小分子物质进行分离提纯作用，同时，我们也发现这个技术具有一定的局限性。首先，装柱的长度决定了凝胶过滤层析分离的能力，因此我们需要分离的物质间相对分子量之差越小，所需的层析柱越高，同时分离的效率也越低，花费时间会变得很多。同时因为场地原因，不可能容纳过长的层析柱，因此这个方法很难分离分子量差距不大的物质。其次，这个技术如果用于生产则效

率非常低，因为要求溶液不能高于凝胶上表面太多（否则导致分离效果变差），就需要增加层析柱的直径，这也是非常不方便的。

同时，如果检测麦清蛋白的浓度使用比色法，则导致分次收集洗脱液的量很大（3ml），这样很可能使得实验中无法收集到蛋白质浓度的峰值。因此我们可以采取需要更少量洗脱液就能检测出蛋白浓度的方法，缩短收集周期，从而更加真实地还原出洗脱曲线。

八、思考题及质疑

用凝胶过滤层析法分离混合样品时，为了得到较好的分离效果，根据技术的理论特点，你认为在实验前的实验设计阶段主要要注意哪些方面？为什么？而在实验的具体操作方面，你认为关键步骤又有哪些？为什么？

答：实验设计的过程中我们主要要注意一下几点：①填料的选取：根据我们需要分离的物质分子直径，选取孔径合适的凝胶颗粒。并且填料不能与实验中与之接触的样品产生化学反应。②柱长与直径的确定：柱长越长分离效果越明显，实验时间也越长；直径越大允许的上样量就越多。我们需要通过样品成分分离所需的长度确定柱长，通过上样量决定直径。同时我们应该考虑凝胶的成本，最终决定柱长与直径。③洗脱液的选取：不能与样品反应，拥有适宜的pH值，能较好地溶解样品中的成分，并且能尽可能平衡填料的表面电荷减少填料对样品成分的吸附作用。④洗脱速度的确定：一定程度上讲，洗脱速度越慢，分离的效果越好，因为如果太快，各组分都会被快速流动的洗脱液带动前进，从而使分子筛失去了作用。一般洗脱速度的确定受到柱长的制约，凝胶柱较长时，洗脱速度可以适当快些，凝胶柱较短时，洗脱速度一定要限制在一定速度之内，否则洗脱效果较差。⑤收集时间的确定：理想的收集是逐滴收集，但是可操作性太差，同时也会涉及无法检测蛋白浓度的问题。因此我们选择可以收集检测浓度最小量的时间作为分段收集的周期。

实验的具体操作上，我认为关键步骤为装柱与上样，因为这两步决定了分离的成败。如果装柱不均匀，有界面或有裂缝或凝胶没有浸没在洗脱液中都会影响分离的结果。同样，上样量如果太多，液面过高也会导致样品中成分无法分离。

九、实验小结

本次实验中我认为最容易出问题的是以下几点：①装柱前搅匀凝胶时玻璃棒与烧杯壁很容易碰触，因此需要放慢搅拌速度。②装柱时边搅拌边倒，有时会过于注意不要洒出而忘记搅拌。③重力洗脱时注意大锥形瓶中的洗脱液要足量，并且管要伸到锥形瓶底部，防止凝胶干掉。④加样后两次冲洗时洗脱液不可以加的过多，尽可能使蛋白质进入凝胶区间的时间差缩短。