亲和色谱分离分离的研究进展

亲和色谱的研究进展

学院：制药与生物工程 专业：生物化工 姓名：张妍 学号：2012255 摘要：亲和色谱是利用生物分子，特别是生物大分子与亲和色谱固定相表面配位体之间，存在的生物学与生物化学过程的特效性亲和吸附作用，来进行选择性分离生物分子的分离方法。亲和色谱具有高选择、高活性回收率和高纯度等特点，至今已在生物化学、分子生物学、基因组学、蛋白质组学、生物工程、临床医学、新型高效药物研究中已成为分离纯化最有效的技术之一，是生物化工研究的重要方向。本文通过查阅文献综述了亲和色谱技术及其发展趋势。 关键词：亲和色谱、配基、分离纯化、研究进展

The research progress of affinity

chromatography

Abstract：Affinity chromatography is a selective separation method which uses the effects of the existence of affinity adsorption in the biological and biochemical

processes between biological molecules, particularly biological macromolecules and ligand on the surface of the affinity chromatography stationary phase. Affinity chromatography with high selection, high recovery and high purity etc., it has been used in biochemistry, molecular biology, genomics, proteomics, biological

engineering, clinical medicine and new high efficiency in drug research. And it has become one of most effective separation and purification technology. This article introduced affinity chromatography simply and reviewed and its development trend. Keywords: Affinity chromatography, ligand, separation, development trend

一、 概述

（一）、 亲和色谱基本概念

亲和色谱是一种利用固定相的结合特性来分离分子的色谱方法。亲和色谱在凝胶过滤色谱柱上连接与待分离的物质有一定结合能力的分子，涉及分子间的范德华力、疏水作用力、静电吸引力、络合作用力以及空间位阻效应等作用力因素，并且它们的结合是可逆的，在改变流动相条件时二者还能相互分离。亲和色谱可以用来从混合物中纯化或浓缩某一分子，也可以用来去处或减少混合物中某一分子的含量。 亲和色谱分离的通常是混合在溶液中的物质，比如细胞内容物、培养基或血浆等。待分离的分子在通过色谱柱时被固定相或介质上的基团捕获，而溶液中其他的物质可以顺利通过色谱柱。然后把固态的基质取出后洗脱，目标分子即刻被洗脱下来。

（二）、亲和色谱法的基本过程是：

1) 配基固相化。将与纯化对象有专一结合作用的物质，连接在水不溶性载体上，制成亲和吸附剂后装柱。 2) 亲和吸附。将含有纯化对象的混合物通过亲和柱，纯化对象吸附在柱上，其他物质流出色谱柱。 3) 解吸附。用某种缓冲液或溶液通过亲和柱，把吸附在亲和柱上的欲纯化物质洗脱出来。如果分离的目的是去除溶液中某种分子，那么只要分子能与介质结合即可，可以不必进行洗脱。 （三）、亲和色谱的分类

自20世纪50年代至今，亲和色谱法已获得巨大的发展，依据亲和色谱固定相键和配位体的不同，可将亲和色谱方法分为生物特效亲和色谱、染料配位亲和色谱法、定位金属离子亲和色谱法、包合配合物亲和色谱法、电荷转移亲和色谱法、共价亲和色谱法、印迹分子亲和色谱法和疏水作用亲和色谱法。由于其基体及配位体的不同其应用对象也各不相同。

其中，生物特效亲和色谱法主要用于生物活性物质，如肽、蛋白质、核苷酸、抗体、抗原、病毒和细胞碎片；染料配位亲和色谱法主要用于核碱、核苷、核苷酸、核酸与核酸键合的蛋白质、生物酶；定位金属离子亲和色谱法主要用于肽、蛋白质、核酸、生物酶；包合配合物亲和色谱法主要用于手性氨基酸、多肽、生物酶、纤维细胞生长因子、凝固因子、脂蛋白及多种手性药物；电荷转移亲和色谱法主要用于氨基酸、肽、蛋白质、核碱、核苷酸；共价亲和色谱法主要用于含硫多肽和蛋白质，含汞多聚核苷酸；印迹分子亲和色谱法主要用于氨基酸、肽、蛋白质、核苷酸、辅酶；疏水作用亲和色谱法主要用于不同蛋白质和核酸[1]。 （四）、影响亲和色谱的因素 1、上样体积

若目标产物与配基的结合作用较强，上样体积对亲和色谱效果影响较小。若二者间结合力较弱，样品浓度要高一些，上样量不要超过色谱柱载量5%-10%。 2、柱长

亲和柱的长度需要根据亲和介质的性质确定。如果亲和介质的载量高，与目标产物的作用力强，可以选择较短的珠子；相反，则应该增加柱子的长度，保证目标产物与亲和介质有充分的作用时间。 3、流速

亲和吸附时目标产物与配基之间达到结合反应平衡需要一个缓慢的过程。因此，样品上柱的流速应尽量的慢，保证目标产物与配基之间有充分的时间结合，尤其是二者间结合力弱和样品浓度过高时。 4、温度

温度效应在亲和色谱中比较重要，亲和介质的吸附能力受温度影响，可以利用不同的温度进行吸附和洗脱。一般情况下亲和介质的吸附能力随温度的升高而下降，因此在上样时可选择较低的温度，使待分离物质与配基有较大的亲和力，充分地结合；而在洗脱时刻采用较高的温度，使待分离物质与配基的亲和力下降，便于待分离物质从配基上脱落。例如，一般选择在4℃进行吸附，25℃下进行洗脱。

二、 亲和色谱的发展历史

1910年，Starkenstein将蔗糖酶抗体吸附到高岭土上，研究了抗体和抗原的相互作用，并发现淀粉酶与不溶解淀粉键合得十分紧密[2]。

1924年，Engelhardt提出“固定配偶原理”作为分离生物活性物质的方法[3]。 1933年，Holmtergh利用淀粉凝胶进行色谱分离从β-淀粉酶中分离出α-淀粉酶[4]。

1951年，Camptell将抗原白蛋白固定在重氮基对氨基苄基纤维上，用以纯化抗体[5]。

1953年，Lerman将偶氮染料固定在纤维素上，纯化蘑菇中的络氨酸酶。 1954年，Grubhofer,Schleith为应用目的，将羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶、核糖核酸酶固定在重氮化氨基聚苯乙酰树脂上。

1959年，Porath和Flodin将葡萄糖Sephadex基体引入亲和色谱中，使亲和色谱得到快速发展。

1963年，Merrifield提出固相肽合成方法，为亲和色谱固定相制备提供了可借鉴的途径。

1964年，Hjerten研制出球形琼脂糖，它与葡聚糖都适用作亲和色谱的基体材质[7]。

1967年，Axen、Porth、Ernback提出用溴化氰活化琼脂糖的方法，为多肽、蛋白质在基体上固定化开辟了新的方法[8]。

1968年，Cuatrecases和Wilchek定义亲和色谱的概念，扩展亲和配位体范围，包括酶、抗原（半抗原）、抗体、激素、维生素、外援凝集素、糖蛋白、膜蛋白、病毒、细胞等。确立了生物特效亲和色谱方法[9]。

1970年，Cuatrecasces进一步完善溴化氰活化琼脂糖的方法，并提出在固相基体和配位体之间插入“空间间隔壁”的概念和方法，成功的解决了配位体的立体可接受性问题，对亲和色谱的发展做出了突破贡献。

1972年，Yon提出利用在水溶液中，非极性官能团之间的接触组合，来分离蛋白质和核酸的硫水作用色谱方法；Wulff提出了印迹分子色谱法[10]。

1973年，Couper提供甲基丙烯酸乙二醇聚酯载体Spheron;Brocklehurst提出用2—吡啶二硫化物作配位体的共价色谱法；Hayman用亲和色谱法分离细胞。 1974年，Epton提供聚丙烯酰吗啉载体Enzacryl；Easterday提出用三苯甲烷染料作配位体的染料配位色谱方法。

1975年，Kristeinsen用亲和色谱法分离病毒。

1977年，Porath提出用2,4-二硝基苯作配位体的电荷转移色谱方法。 1978年，Porath提出用金属离子螯合物作配位体的定位金属离子亲和色谱方法；Ohlson提出以大孔微粒硅胶作载体的高效液相亲和色谱法。

1980年到1990年，β-CD、冠醚、穴醚、杯芳烃、大环抗生素、用作亲和包合配位体，发展了包合配合物亲和色谱方法。Armstrong首先应用包合配合物亲和色谱方法。

1990年到2000年，新型载体获广泛应用，如灌注色谱固定相Poros；无极氧化物：ZrO2,，TiO2,CeO2,WO3及杂化材料：ZrO2-脲醛树脂复合微球[11]。 随着HPLC色谱柱制备技术的迅速发展，亲和色谱也应用了新型色谱柱；内壁键合三嗪染料的开管毛细管亲和色谱柱；甲基丙烯酸缩水甘油酯-二甲基丙烯酸亚乙基脂作基体，键合生物特效配位体或燃料的整体柱；键合维生素的纳米芯片亲和色谱柱。

三、 亲和色谱国内外研究现状

膜亲和色谱是人们将亲和色谱和膜技术结合起来研制的，以膜为基质的亲和色谱，其基本原理是将微滤膜或超滤膜经表面改性活化处理后，偶联上合适的配基，使固定在膜载体上的配基特异性地与待分离的生物大分子结合成复合物，再经洗脱是生物大分子得以分离纯化。因此亲和膜色谱技术即具有膜技术分离快，处理量大的特点，又具有亲和色谱特异性高的优点。目前亲和膜色谱法已成为分离纯化生物大分子的重要手段之一。链接到膜基质上的配体分为两大类：生物特异性配体和基团特异性配体，后者又称为通用性配体。以此为依据，可以对膜亲和色谱法进行分类，常见的有生物亲和色谱，免疫亲和色谱，金属螯合亲和色谱等。

生物亲和色谱中连接到基质上的配体是存在特异性相互作用的生物大分子，如酶与底物，酶与抑制剂，激素与受体等，因而具有高度的选择性。但是这类生物大分子通常价格昂贵且不易连接到基质上，限制了它们在大规模工业生产中的应用。

免疫亲和色谱是将抗原抗体中的一方连接到基质上来吸附纯化另一方的色谱分离技术。随着可利用的单克隆抗体技术的发展，免疫亲和色谱的应用日益广泛，期工业化应用前景广阔。

金属螯合亲和色谱又称固定化金属螯合亲和色谱，是Porath等首先提出来的。在上世纪70年代他们将铜离子、锌离子通过螯合剂亚氨基二乙酸交联到