石斛的多糖提取及其多酚物质的抗氧化性研究

铁皮石斛皮萃取物，在536nm处测量各浓度下的吸光度A，便能测定被测物对·OH的清除作用。 测定方法

羟基自由基（.OH）清除活性的测定参照文献方法。向10 mL比色管中依次加入0.4 mL 0.75 mmol/L的邻二氮菲溶液，1.0 mL pH =7.4的磷酸缓冲溶液，0.3 mL 0.75 mmol/L硫酸亚铁氨溶液和0.2mL铁皮石斛皮萃取物乙醇溶（0.2–2.00/mL），最后加入1.0 mL 0.01%的H2O2溶液，以二次蒸馏水定容至刻度。在37℃水浴中恒温60 min，于536 nm下测吸光度A。，以上每加1次试剂均需摇匀，同时测定不含萃取物的空白样品，作自由基清除率-浓度图。按下式计算样品对.OH的清除率:

SC (%) = (A样 - A损) / (A未损 - A损) × 100%。

式中A样为加样液的吸光度，A损为不加样液、样液用溶剂代替的吸光度，A未损为不加样液和H2O2的吸光度(三者均以蒸馏水空白为参比)。

3.2.3 铁皮石斛乙酸乙酯萃取物清除超氧阴离子自由基（·O2-）的测定 测定原理

采用邻苯三酚自氧化法测定。邻苯三酚在碱性条件下能够迅速自氧化形成中间产物超氧阴离子自由基（·O2-）[18]，此自由基能促进邻苯三酚的自氧化，当加入清除剂后能够清除其中的超氧阴离子自由基（·O2-），从而使邻苯三酚的自氧化速率降低，其自氧化反应速率被抑制的大小显示·O2-被清除程度的强弱。

由于邻苯三酚的自氧化是一类链式反应，在其自氧化过程中，超氧阴离子自由基（·O2-）不断被消耗又不断生成，当达到平衡时自由基（·O2-）的浓度保持恒定。邻苯三酚在自氧化过程中，生成在325nm处有最大吸收的中间产物（此值是通过紫外扫描而得到），当加入的清除剂对邻苯三酚自氧化的抑制越强，则生成在325 nm处有光吸收的中间产物就会越少，测得的吸光度也就越低。而当pH < 9时，邻苯三酚的自氧化率与·O2-浓度成正比。因此通过测定某物质对邻苯三酚自氧化的抑制作用,即可表征其对·O2-的清除作用。 测定方法

超氧阴离子自由基（.O2-）的清除活性测定参照文献 [19—20] 的测定方法。取4 mL pH = 8.0 Tris–HCl缓冲液(50 mmo1/L)，4.2 mL蒸馏水, 混匀后在25 ℃水浴中

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保温20 min。取出后立即加入温度为25 ℃，0.3 mL 3 mmol/L 邻苯三酚溶液中 (以10 mmo1/L HCl配制)，立刻计时并迅速摇匀，然后在波长325 nm下测定吸光值，1 min后记录数据，每隔30 s记一次，每隔一分钟测取一次吸光度。计算线性范围内每分钟吸光值的增加△A0。空白管用l0 mmol/L HCl代替邻苯三酚的HCl溶液。

取同浓度的铁皮石斛萃取物进行实验，在加入邻苯三酚前,先加入一定体积的样品溶液，然后按上述方法操作，计算线性范围内每分钟吸光值的增加△A，计算抑制率。作抑制率-浓度图。超氧阴离子自由基清除率按下式计算：

SC (%) = (△A0 - △A) / A0 × 100%

式中，△A0为邻苯三酚的自氧化速率；△A为加入样品溶液后邻苯三酚的自氧化速率,单位均为吸光值每分钟的增加值。 3.2.4 铁皮石斛乙酸乙酯萃取物还原能力的测定 测定原理

鲁士蓝法，其原理是样品中具有还原能力的成分可以将铁氰化钾还原成为亚铁氰化钾，亚铁氰化钾再与三价铁离子作用形成普鲁士蓝[Fe(Fe(CN)6)3]，普鲁士蓝在700nm下吸光值越高，表示样品的还原能力越强。一般情况下,样品的还原能力与其抗氧化活性之间有显著的相关性，还原能力的高低可以间接反映抗氧化能力的强弱。 测定方法

还原能力的测定参照文献[21—22]的测定方法。在6支10 mL具塞刻度比色管中依次加入2.5 mL pH = 6.6的磷酸缓冲溶液、1mL不同浓度的铁皮石斛萃取物（0.40、0.60、1.0、1.20、1.40、1.80mg/mL）、2.5 mL 1%的铁氰化钾溶液。将混合物放在50 ℃水浴中反应20 min，再加入2.5 mL 10%的三氯乙酸，混匀后以3000 r/min进行离心分离10 min，取上层清液1.0 mL（经过滤膜过滤），往清液中加7.0 mL蒸馏水和0.5 mL 0.1%的三氯化铁溶液，在700 nm处测吸光值。吸光度越高，说明混合物的还原能力越强。作吸光度-浓度曲线图。 4、 结果与讨论

4.1 对DPPH自由基的清除能力

由图二我们可知：随着铁皮石斛多酚浓度的增大，其对DPPH自由基的清除能力

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也随之变强。铁皮石斛多酚浓度小于1.4mg/mL时，其浓度与清除率成一定的量效关系；大于1.4mg/mL时，清除率不再随浓度的增大而变大，而是比较稳定。作为阳性对照的BHT，在与铁皮石斛多酚浓度相同时，其对DPPH的清除率低于铁皮石斛多酚。但是，在其浓度为1.2mg/mL时，它的清除率也基本不再随BHT浓度的增大而增大。在两者浓度均为最大时，它们的清除率分别为73.8%和63.6%，并且铁皮石斛多酚浓度在1.4mg/mL时对DPPH的清除率已经大于BHT浓度在2.0mg/mL时对DPPH的清除率。由此，我们可以得出结论：铁皮石斛多酚对DPPH自由基具有很好的清除能力。

0.80.70.60.50.40.30.20.100.20.40.60.81.01.21.4浓度（mg/mL）1.61.82.0百分数铁皮石斛清除率BHT清除率

图二 铁皮石斛多酚与BHT对DPPH的清除率对比

4.2 对羟基自由基（·OH）的清除能力

通过对图三进行对别分析：随着铁皮石斛多酚和BHT浓度的增大，二者对羟基自由基的清除率是稳步增长的，并且铁皮石斛多酚的清除率远高于BHT的清除率。当铁皮石斛多酚的浓度为1.5mg/mL时，它的清除率(56.1%)基本与BHT浓度2.0mg/mL的清除率(56.4%)大致相同。并且，当铁皮石斛浓度为2.0mg/mL时，它的清除率居然高达89.7%。故而，铁皮石斛多酚对羟基自由基有相当高的清除活性，且远高于阳性对照BHT对羟基自由基的清除活性。

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百分数10.90.80.70.60.50.40.30.20.10铁皮石斛清除率BHT清除率 1 0.4 2 0.6 3 0.8 4 1.0 5 1.2 6 1.4 7 1.6 8 1.8 9 2.0 10 0.2 浓度（mg/mL）

图三 铁皮石斛多酚与BHT对羟基自由基的清除率对比

4.3 对超氧阴离子自由基（·O2-）的清除能力

我们对图四观察可知，浓度与清除率的量效关系与图三的趋势大致一样。铁皮石斛多酚和BHT对超氧阴离子自由基的清除活性均随浓度的增大而增强。铁皮石斛多酚浓度1.3mg/mL时的清除率(72.1%)与BHT浓度2.0mg/mL时的清除率(72.3%)几乎相等。并且在两者浓度都为最高时，它们的清除率分别达到83.6%和72.3%，均表现出对清除超氧阴离子自由基较强的活性。

0.90.80.70.60.50.40.30.20.10铁皮石斛清除率BHT清除率百分数2 0.6 3 0.8 4 1.0 5 1.2 6 1.4 7 1.6 8 1.8 9 2.0 10 0.2 0.4 浓度( mg/mL )

图四 铁皮石斛多酚与BHT对超氧阴离子自由基的清除率对比

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