石斛的多糖提取及其多酚物质的抗氧化性研究

培养基中培养，萌发率可以达到90%。曾宋君等[7—8]用相似的方法亦得到基本一致的结论。除种子作为植物体外，以铁皮石斛的茎尖、茎段、幼叶种胚苗、幼根为外植体，均可培养出组培苗[9]。大致过程为：茎尖、茎段→诱导形成不定芽→不定芽增殖→不定芽分化→生根壮苗、形成完整试管苗。

目前浙江、安徽、广西等地都有铁皮石斛的种植基地，他们的品种也是各不相同。如今的铁皮石斛在全球拥有大概1500多种杂交种，很多品种在抗虫害等方面都有优良性能。我国较为出名的有“仙斛1号”、“中科3号”、“惠农1号”、“惠农2号”等品种。 1.4 本文研究的意义：

多糖具有广泛的生物活性和功能，功能性多糖一般为天然产物提取，多糖的含量直接关系到药物的药性，并且植物多糖的含量和其含水量实密不可分的，于是我们测定了铁皮石斛的含水量并提取测定了其多糖含量。

英国学者Harman1956年创立自由基衰老学说以后，自由基生命科学的研究便日益深入。自由基（Free radical）攻击生命大分子造成组织细胞损伤，是引起机体衰老的根本原因，也是诱发肿瘤等恶性疾病的重要起因。自由基是机体的有效防御系统，生物体内常见的自由基有：超氧阴离子自由基（·O2—）、羟基自由基（·OH）、烷氧基自由基（RO·）等[10]。摄入抗氧化性物质可有效抵消自由基氧化对人体的损害，但是，目前人们常用的抗氧化剂主要是通过人工合成的，如BHT、叔丁基羟基茴香醚（BHA）等。人工合成的抗氧化剂会对机体产生一定毒性和致癌作用[11]，而一些天然植物含有黄酮类、酸酚等多酚类抗氧化成分。于是，我们对铁皮石斛的抗氧化性作了研究。 2、 铁皮石斛的水分测定及其多糖的提取 2.1水分的测定

取三只烘干的烧杯，编号。将样品切段后放入烧杯，称量其质量，放入105C的烘箱中。等四个小时后取出烧杯冷却称量，再放入烘箱中30min后再取出称量。

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表2 铁皮石斛含水量的测定

放样品烧杯质量（g） 第一次冷却称量（g） 第二次冷却称量（g）

含水量（%） 平均含水量（%）

1号样 46.166 42.603 42.599 71.94%

2号样 55.602 50.907 50.907 81.54% 76.80%

3号样 37.319 33.290 33.288 76.91%

2.2多糖的提取

多糖的提取[12]首先要根据多糖的存在形式及提取部位，决定在提取之前是否做预处理。植物多糖提取时需注意一些含脂较高的根、茎、叶、花、果及种子类，在提取前，应先用低极性的有机溶剂对原料进行脱脂预处理，目前多糖的提取方法主要有溶剂提取法、生物提取法、强化提取法等。我们这里选用溶剂提取法——水提醇沉法。

水提醇沉法是提取多糖最常用的一种方法。多糖为极性大分子化合物，根据相似相溶的原理，提取时我们选用极性强的水、醇为溶剂。利用植物中大多数成分如生物碱盐、有机酸类、氨基酸、多糖等易溶于水和醇的特性，用水提取，并将其提取液浓缩，加入适当的乙醇反复数次沉降，除去其不溶物质。由于多糖不溶于乙醇，我们加入80%的乙醇，使多糖从提取液中沉淀出来。虽说该法提取比较耗时，提取率也不高，但是该法不需要特殊设备，非常适合实验室采用。 实验过程大致如下：选材称量→切段→榨汁→乙醇回流提取（3—5次）→粗纤维与多糖细浆分离（过80目和50目筛子）→旋转蒸馏→回收→多糖浸膏。铁皮石斛样为403.161g，得到的浸膏为19.088g，多糖的获得率为4.73%。 3、 铁皮石斛乙酸乙酯萃取多酚物质抗氧化性的研究 3．1 铁皮石斛乙酸乙酯萃取母液及浓度梯度的配制

称取铁皮石斛乙酸乙酯提取物0.5 g，溶于95%乙醇溶液，并用乙醇定容至100 mL容量瓶,取10个10 mL容量瓶，分别配制成0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、

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0.8mg/mL、1.0mg/mL、1.2mg/mL、1.4mg/mL、1.6mg/mL、1.8mg/mL、2.0 mg/mL浓度梯度的乙醇样液。 主要试剂的配制

DPPH溶液（0.008 mg/ml ）：称取DPPH粉末0.002 g，用乙醇定容于250 mL棕色容量瓶中，避光保存，现配现用。

pH=7.4磷酸缓冲溶液：称取磷酸二氢钠0.7800 g，蒸馏水定容于25 mL容量瓶中；称取磷酸氢二钠7.1628 g，用蒸馏水定容于100 mL容量瓶中；分别从中移取19 mL和81 mL于100 mL容量瓶中。

H2O2（0.01%）：移取30%的过氧化氢0.25 mL，用蒸馏水定容至25 mL容量瓶中。用水再稀释30倍。

邻二氮菲（0.75 mmol/L）：称取邻二氮菲粉末0.0149 g，用乙醇定容至100 mL容量瓶中。

硫酸亚铁氨（0.75 mmol/L）：称取硫酸亚铁氨0.0294 g, 用蒸馏水定容于100 mL容量瓶中。

盐酸（0.1 mol/L）：移取2.12 mL浓盐酸用蒸馏水定容至250 mL容量瓶中。 Tris-HCl缓冲液（pH=8.0，0.05mo1/L）：称取三羟甲基氨基甲烷2.4228 g，用蒸馏水定容至100mL，并从中移取27.5 mL与25 mL 0.1 mol/L盐酸混合，用蒸馏水定容至100 mL容量瓶，避光保存。

盐酸（10 mmol/L）：移取10 mL 0.1 mol/L盐酸，用蒸馏水定容至100 mL容量瓶中。

邻苯三酚溶液（2.5mmol/L）：称取0.0316g邻苯三酚用10mmol/LHCl溶液溶解后定容至100mL，避光保存。

pH = 6.6磷酸缓冲溶液：称取磷酸氢二钠7.1628 g，定容于100 mL中，称取磷酸二氢钠3.1202g，定容于100 mL容量瓶中，并分别从中移取37.5 mL和62.5 mL于100 mL容量瓶中。

三氯化铁溶液（0.1%）：称取三氯化铁粉末0.1 g,用蒸馏水定容至100 mL。 铁氰化钾溶液（1%）：称取铁氰化钾粉末1 g,用蒸馏水定容至100 mL，注意现配现用。

三氯乙酸溶液（10%）：称取三氯乙酸粉末10 g,用蒸馏水定容至100 mL。

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3.2 实验测定原理及方法

3.2.1 铁皮石斛乙酸乙酯萃取物清除DPPH自由基的测定 测定原理

二苯代苦味酰自由基（DPPH）是一种稳定的自由基，可以长时间保存。它在517nm处有一强吸收，当有自由基清除剂存在时，由于与其单电子配对而使其吸收逐渐消失，其褪色程度与所接受的电子数成定量关系[13—14]。因而，国内外广泛将此法用于自由基清除剂的筛选研究。该法可以用来表征某种物质对自由基的清除能力，通常用清除率表示。清除率越大，表明该物质清除自由基的能力越强。本试验通过测试对DPPH自由基的清除能力来评定铁皮石斛乙酸乙酯萃取物的抗氧化活性。 测定方法

本实验参考文献的测定方法并加以改进。取0.008mg/mL的DPPH乙醇溶液4.0 mL，分别取0.5mL不同质量浓度（0.20–-2.00 mg/mL）的铁皮石斛乙酸乙酯萃取物加入到DPPH乙醇溶液中，摇匀，于28 ℃水浴锅中水浴恒温30分钟，然后在515 nm下迅速测其吸光度记为A样品，同时测定不含提取物的空白样品记为A空白，清除率SC (%)计算公式为：

SC (%) = (1- A样品 / A空白) × 100%

式中A样品为试样的吸光度，A空白为空白样品的吸光度。

3.2.2 铁皮石斛乙酸乙酯萃取物清除羟基自由基（·OH）的测定[15—17] 测定原理

邻二氮菲2Fe2+在536 nm处有最大吸收，根据Fenton反应原理，H2O2与Fe2+

混合产生·OH，而羟自由基可以把邻二氮菲2Fe2+氧化为邻二氮菲2Fe3+，使邻二氮菲2Fe2+在536 nm处的最大吸收峰变弱或消失。若在反应体系中加入具有清除·OH功能的被测物，被测物便会与邻二氮菲2Fe2+竞争·OH，从而使氧化反应减慢，消耗邻二氮菲2 Fe2+的量就会减少，因此溶液在536 nm处的最大吸收峰变化程度就小。因此可根据536 nm处吸光度的变化程度判断被测物清除·OH的能力。我们采用固定反应时间法，在相同体积的反应体系加入一系列不同浓度的

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