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基因工程复习汇总
基因工程
一、名词解释
1. 基因: 是DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位。 2. 定位克隆: 获取基因在染色体上的位置信息，然后采用各种方法对该基因进行定位和克隆 3.DNA重组：是由于不同DNA链的断裂和连接而产生DNA片段的交换和重新组合，形成新DNA分子的过程。
4.克隆：科学家把人工遗传操作动物繁殖的过程叫克隆，这门生物技术叫克隆技术，其本身的含义是无性繁殖，即由同一个祖先细胞分裂繁殖而形成的纯细胞系，该细胞系中每个细胞的基因彼此相同。
5.DNA克隆：应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质——同源或异源、原核或真核、天然或人工的DNA与载体DNA相结合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子，继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子，即DNA克隆。
5. 融合基因: 是指应用DNA体外重组技术构建的一类具有来自两个或两个以上的不同基因核苷酸序列的新型基因。
6. RT-PCR: 是指以mRNA在反转录酶作用下合成cDNA第一链为模板进行的PCR。 7. ORF : 起始于AUG、止于UAA、UGA、UAG的连续的密码子区域，是潜在的编码区。 8. MCS: 指载体上人工合成的含有紧密排列的多种限制核酸内切酶的酶切位点的DNA片段。 9.基因工程：在体外把核酸分子（DNA的分离、合成）插入载体分子，构成遗传物质的新组合（重组DNA），引入原先没有这类分子的受体细胞内，稳定地复制表达繁殖，培育符合人们需要的新品种（品系），生产人类急需的药品、食品、工业品等。
10. 5’RACE: 是一种通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术，是以mRNA为模板反转录成cDNA第一链后用PCR技术扩增出某个特异位点到5’端之间未知序列的方法。
11.cDNA library:cDNA文库：是指某生物某一发育时期所转录形成的cDNA片段与某种载体连接而成的克隆的集合。
12.载体：能载带微量物质共同参与某种化学或物理过程的常量物质，在基因工程重组DNA技术中将DNA片段（目的基因）转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子。三种最常用的载体是细菌质粒、噬菌体和动植物病毒。
13.基因诊断：又称DNA诊断或分子诊断，通过分子生物学和分子遗传学的技术，直接检测出分子结构水平和表达水平是否异常，从而对疾病做出判断。
14.限制性核酸内切酶：是由细菌产生的一类能特异识别双链DNA中的特定碱基序列，并在识别位点切割磷酸二酯键的核酸内切酶(简称限制酶)。
15.基因文库：将所有的重组DNA分子都导入宿主细胞进行扩增，得到分子克隆的混合体，这样一个混合体称为基因文库。
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16.cDNA文库：从组织细胞中分离得到纯化的mRNA，然后以mRNA为模板，利用逆转录酶合成其互补DNA，再复制成双链cDNA片段，与适当载体连接后导入受体菌内，扩增，构建cDNA文库。 17.RFLP：RFLP标记是发展最早的DNA标记技术。RFLP是指基因型之间限制性片段长度的差异，这种差异是由限制性酶切位点上碱基的插入、缺失、重排或点突变所引起的。
18.核酸探针：是指与特定的靶分子发生特异性相互作用，并可被特殊的方法探知的分子。抗体-抗原、生物素-抗生物素蛋白、生长因子-受体的相互作用都可以看作是探针与靶分子的相互作用。 19.Shuttle plasmid vector穿梭质粒载体：指一类由人工构建的具有两种不同复制起点的选择标记，因而可在两种不同宿主细胞中存活和复制的质粒载体。
20.限制与修饰系统：限制酶的生物学功能一般被认为是用来保护宿主细胞不受外源DNA的感染，可讲解外来DNA，从而阻止其复制和整合到细胞中。一般来说，与限制酶相伴而生的修饰酶是甲基转移酶，或者说是甲基化酶，能保护自身的DNA不被讲解。限制酶和甲基转移酶组成限制与修饰系统。
21.星活性：在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特征称为星星活性。 二、简答题 1.载体的分类
按功能分：克隆载体：（主要用于扩增或保存DNA片段，是最简单的载体。具有强大的包装能力） 表达载体：（带有目标细胞识别的启动子） 其他载体：（整合载体、穿梭载体等）
按进入受体细胞类型分
（1）原核载体 （2）真核载体 （3）穿梭载体
按来源分： 质粒（细菌等原核生物染色体外遗传物质） 噬菌体（原核细胞的病毒） 真核病毒（真核细胞的病毒）
人工遗传物质（噬菌粒、粘粒、细菌、酵母等） 2、基因克隆载体必备条件：
1）具有多种单一核酸内切酶切割位点（多克隆位点）一个或多个)外源DNA插入，不影响载体复制。 2）能携带外源DNA片段进入受体细胞能自我复制，或整合到染色体随受体细胞DNA复制而复制。
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3）有选择克隆子的标记基因（筛选标记）。 4）分子量小，拷贝数高，易从宿主细胞中分离。
5）安全性(不含损害受体的基因,不任意转入别的,尤其人的细胞)。 3、表达载体和基因工程一般克隆载体在元件构成上有何差别？
表达载体：启动子；终止子；核糖体结合位点（SD序列）；筛选标记；复制子（质粒拷贝数）；多克隆位点
克隆载体：筛选标记；复制子（质粒拷贝数）；多克隆位点 4、原核表达载体与真核表达载体及穿梭载体的区别
1)真核表达载体和原核表达载体就是能在真核生物或原核生物中表达的载体,它们一般都带有能在真核生物或原核生物中表达的必需表达元件;
2)真核表达和原核表达的目的都是为了能够大量获得自己所需要的目的基因的表达产物,最好有生物活性,以便下一步的实验需要.
3)原核表达载体一般只能在原核生物中表达外源基因,但有些穿梭载体可以分别在真核和原核生物中表达它们的表达元件. 5、什么是包涵体？
重组蛋白在胞内表达时，常常以不溶性蛋白聚集成的晶状物形式存在，这种晶状体即包涵体。包涵体的形成是外源蛋白的高效表达时的普遍现象，这是由于肽链折叠过程中部分折叠的中间态发生了错误聚合，而不是形成成熟的天然态或完全解链的蛋白。 探针标记的方法：
（1）缺口平移法 （Nick Translation）
原理及过程：反应体系中DNA酶I随机在探针DNA上打开缺口，然后利用DNA聚合酶I 5’ → 3’外切酶活性，在缺口处按5’→ 3’方向切除单核苷酸；同时DNA聚合酶I有5’ → 3’的聚合酶活性，在缺口处3’端加入底物中的单核苷酸，弥补缺口处的核苷酸链。随着反应的进行底物中被标记单核苷酸，并被随机掺入。DNA聚合酶I的两种作用交替进行，探针即被标记。 （2）随机引物法（6核苷酸引物标记法）
原理及过程：利用E.coli DNA聚合酶I的Klenow亚单位，合成含有标记核苷酸的DNA链。Klenow具有5’→ 3’聚合酶活性。被标记的DNA（探针）变性成单链，引物与模板结合。在Klenow的催化下，以引物3’端为起点，沿模板3’ → 5’方向合成DNA新链。反应体系中含有标记的dNTP,随机掺入新合成的DNA链中，探针即被标记。 （3）末端标记
多核苷酸激酶的用途:DNA5'-OH端磷酸化、标记DNA的5’端。包括正向反应和交换反应标记法 6、PCR反应的基本原理：
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1）变性：在PCR反应体系中，通过加热使温度至95℃左右，使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA作为反应模板。
2）退火：PCR反应中，经变性后将温度降至引物的TM值左右或以下，引物与DNA模板互补区域结合，形成杂交链的过程。
3）延伸：当反应体系温度升至70℃左右时，TaqDNA聚合酶催化以引物为起始点的5‘→3’延伸反应，形成新生DNA链。 7、引物设计的基本原则
最大限度地提高扩增效率和特异性，同时尽可能抑制非特异性扩增。 （1）引物长度一般为15~30个核苷酸。
（2）碱基随机分布，避免出现嘌呤，嘧啶的堆积现象。G+C的含量为45~55%。（3′端和5′端引物具有相似的Tm值。Tm=4（G+C）+2（A+T）。引物长度要确保解链温度不低于54°C。） （3）两个引物之间不应存在互补序列，尤其应避免3′端的互补重叠，连续互补序列一般不超过3bp。
（4）引物的碱基序列不应与非扩增区域有同源性。
（5）引物3′端碱基一定要与模板DNA配对，最佳碱基选G和C而不用A。
（6）引物的5′端没有严格限制，可以修饰，如加限制酶位点，引入突变位点，起始密码子，终止密码子等。
8．简述获得目的基因常用的几种方法。（5分） （1）直接从染色体DNA中分离：（1分）
仅适用于原核生物、叶绿体和线粒体基因的分离，较少采用。 （2）人工合成：（1分）
根据已知多肽链的氨基酸顺序，利用遗传密码表推定其核苷酸顺序再进行人工合成。适应于编码小分子多肽的基因。
（3）从mRNA合成cDNA：（1分）
采用一定的方法钓取特定基因的mRNA，再通过逆转录酶催化合成其互补DNA（cDNA），除去RNA链后，再用DNA聚合酶合成其互补DNA链，从而得到双链DNA。这一方法通常可得到可表达的完整基因。
（4）利用PCR合成：（1分）
如已知目的基因两端的序列，则可采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术，在体外合成目的基因。
（5）从基因文库中筛选：（1分）
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