植物组织培养

实验五

营养培养基配制和灭菌

一．营养培养基配制程序 （一） 母液吸取量的计算

配制培养基的升数

公式 1：母液吸取量= 母液体积（CC）×——————————

母液浓缩倍数

培养基要求的含量

公式 2：母液吸取量= ———————————（各种生长调节剂）

母液每 CC 的含量

（二） 各种母液按顺序编号排列

A. 大量元素 ； B.CaCl2 · 2H2O； C.微量 元素 ； D.铁盐； 水 定容至 1000ml；G..细胞分裂素、激动素（KT）配制 0.5mg/ml的KT 量 1N HCL溶解 后，加蒸馏水定容至 100ml。 （三） 配制培养基

1. 琼脂: 称取 8g 琼脂，加入 300ml 蒸馏水，加热溶解直至完全溶解为止。 2. 蔗糖 3%：称取 30g 蔗糖，溶于溶有琼脂的 300ml 蒸馏水中。 3. 各种母液的吸取

（1） 用 50ml量筒量取大量元素母液（A）和CaCl2·2H2O母液（B）各 100ml （2） 分别用 10ml 移液管或吸管吸取微量元素（C），铁盐（D）母液各 10ml （3） 用 10ml 移液管或吸管吸取有机物（H）10ml

（4） 用 2ml 移液管吸取生长素 NAA1.5ml；用 0.5ml 移液管吸取 KT0.5ml

将上述溶液全部混合于琼脂与蔗糖溶液中，混合均匀后，加热至 80℃左右，用酸度计或精密 pH 试纸测定培养基的 pH 一般要求 5.8~6.0，过酸过碱则用 1N NaoH 和 1N HCl 调整。 二．分装：用一个接有胶管的分装器趁热装培养基，1000ml 培养基分装 70 支试管，即每支试管 15ml 左右（一般占试管、三角瓶容量 1/4~1/3 左右）注：培养基勿碰试管壁。

三. 包装：分装好的试管用棉塞塞上，包上包装纸，每 5~7 支试管捆成一扎，标明培养基代号即可 进行灭菌。

用具清理和洗涤：各种母液按原位置摆整齐，用过的量筒，移液管、烧杯、铝锅等用水洗涤干净， 然后按次序放回原处。 四．灭菌：固体营养培养基灭菌通常都用热压法，液体培养基可用热法，也可用过滤法，现操作热 压法灭菌。

E.有机物； 称 50mgKT用少

F．生长素萘乙酸（NAA）：配制 0.5mg/ml的NAA称取 50mg ， NAA用少量 95% 酒精溶解后加蒸馏

热压灭菌的锅具有温度范围 115~135℃，良好的灭菌取决于时间、压力、温度和被灭菌的容积， 此法优点是：迅速、简便、全部微生物和病毒均能被破坏并无吸附现象。缺点：（1）会引起 PH 改 变：降低 0.3~0.5 个单位值；（2）某些化合物会分解或发生化学反应，在太高温度下热压处理会使糖 焦化。这种产物可能有毒；（3）热压灭菌时间太长会使盐沉淀下来；（4）会使琼脂解聚；（5）导致 某些有机的生理活性物质的活力下降。因此，为达到良好的灭菌效果，而又尽量减少对营养成分的 不利影响要求。

（1） 盛有 20~50ml 营养培养基的容器就在 121℃中保持 20 分钟； （2） 盛有 50~500ml 营养培养基的容器就在 121℃中保持 25 分钟；

（3） 盛有 500~5000ml 营养培养基的容器就在 121℃中保持 35 分钟； 具体操作步骤： 1. 高压锅放水至平把架； 2. 把包扎好的培养基装入高压锅;

3. 盖上热压锅盖,上紧螺帽(注意对角拧紧螺帽)关上气阀和安全阀. 4. 把热压锅放在 3000W 电炉座上,然后接通电源.

5. 压力计升至 0.5Kg 时，打开放气阀,排除冷空气(此步很重要)反复两次至完全把冷空气排除。 6. 排除冷空气后,关闭放气阀，待压力升到 1Kg 位置时，开始计算灭菌时间，一般在 1Kg 压力(121 ℃)下灭菌 20~25 分钟即可，但要注意保持稳定压力。

7. 灭菌时间达到 20 分钟后，除去电源，打开放气阀(注意要逐渐放气)待高压锅内的空气完全排除 后，打开热压灭菌锅盖(注意对角扭松螺帽)稍待冷后再把培养基取出。

8. 经过灭菌的营养培养基不宜放置太长，应尽早使用，但为了在使用前能检查培养基有无微生物 污染，可将培养基置于 25℃下保存 4 天，如果培养基需要贮存较长时间，可在 4℃低温下保存。 灭菌高压锅有大型卧式、中型立式、小型手提式等多种型号和规格，无论哪种型号，操作的步骤 都很相近。

进水→放进培养基→盖紧锅盖→关上放汽阀→检查安全阀→接上加热源→待压力升至 0.5Kg 时 排锅内冷空气，重复两次,直至冷空气排除，关上放气阀→1Kg 压力(121℃)下灭菌 20~25 分钟，保持 稳定压力→除热源→逐渐打开放气阀→锅内空气排除完后→开放锅盖→稍冷后取出培养基。 五.作业

1. 配制培养基：

①MS+2mg/L 2，4-D +0.8%琼脂（PH5.8）；

②MS+0.5mg/L 2，4-D +0.5mg/L6-BA+0.8%琼脂（PH5.8）； ③MS+0.5mg/L 2，4-D +1.0mg/L6-BA+0.8%琼脂（PH5.8）； ④MS+2 mg/L 2，4-D+0.5mg/L6-BA +0.8%琼脂（PH5.8）； ⑤MS+2mg/L 2，4-D +1.0mg/L6-BA+0.8%琼脂（PH5.8）

外植体的分离、接种和培养（初代培养）

植物组织培养的成功首先在于初代培养，即能否建全起于无菌外植体，注意几个重要环节。 一．保证无菌 主要保证培养材料和培养基的无菌状态

培养室的良好的清洁环境，以及工作人员的无菌操作技术，材料灭菌，不同作物，一株不同部 位都有不同的要求，常用的消毒剂有漂白粉（1%~10%的溶液），次氯酸钠液（0.5~10%）乌斯普龙 溶液(800~1500 倍)，升汞（HgCl 0.1~1%）酒精 70% ，双氧水(3~10%)等。材料灭菌的方法视不同作 物，不同部位而异(1)茎尖、茎段及叶片等的消毒，因暴露于空气中，有较多的茸毛、油脂、蜡质和 刺等，首先用自来水较长时间冲洗，特别多年生木本材料更注意，有的可用肥皂、洗衣粉或吐温等 进行洗涤→酒精浸泡数秒钟→无菌水冲洗 2~3 次→按材料老、嫩用枝条的坚实程度，分别用 2%~10% 次氯酸钠溶液浸泡 10~15 分钟→无菌水冲洗 3 次→接种。 （2）果实及种子消毒，果实：自来水冲 洗 10~20 分钟→纯酒精迅速漂洗一下→2%次氯酸钠溶液浸泡 10 分钟→无菌水冲洗 2~3 次→取出果 内种子或组织进行培养。 种子：自来水冲洗 10~20 分钟→10%次氯酸钙浸泡 20~30 分钟甚至几个 小时，依种皮硬而定，对难于消毒的还可用 0.1%升汞或 1%~2%溴水消毒 5 分钟，进行胚或胚乳培 养，对种皮太硬的种子，也可预先去掉种皮再用 4~8%次氯酸钠溶液浸泡 8~10 分钟→无菌水冲洗后 →接种。

（3）花药消毒 用于培养的花药，实际上多未成熟，外有花萼，花瓣或颖片保护，处于无菌状态， 所以只要将整个花蕾或幼穗消毒即可，一般用 70%酒精浸泡数秒钟→无菌水冲洗 2~3 次→漂白粉清 液浸泡 10 分钟→无菌水冲洗 2~3 次→接种。

（4）根及地下部分器官的消毒，这类材料生长于土中，消毒较为困难，先用自来水洗涤，用软毛刷 刷洗→用刀切去损伤及污染严重部位→吸干后→纯酒精漂洗→0.1%~0.2%升汞浸泡 5~10 分钟或 2% 次氯酸钠溶液浸泡 10~15 分钟→无菌水冲洗 3~4 次→无菌滤纸吸干后→接种。若上述方法仍不见效 时,可将材料浸入消毒液中进行抽气减压帮助消毒液的渗入达到彻底灭菌的目的。

二．条件合适 要成功地建立初代培养，首先一定要选择好合适的作物种类，品种及培养部位，目前组织培养已

经获得成功的植物，几乎包括植物的各个部位，在生产实际中，必须选取最易表达全能性的部位， 增加成功机会，降低生产成本，大多数植物茎尖是较好的部位，由于其形态已基本建成，成长迅速、 遗传性稳定，也是获得无病毒的主要途径，但茎尖往往受到材料来源的限制，为此茎段也得到了广 泛的应用，而叶片的培养利用更为普遍，材料来源最为丰富，一些培养较困难的植物则往往可以通 过子叶，下胚轴培养奏效。花药和花粉培养成为育种和得到无病毒苗的主要途径之一，其他可根据 需要采用根，花瓣鳞茎等部位培养，总之，在确定取材部位时，一方面要考虑培养材料的来源有保 证、容易成苗，另一方面要考虑到特别是通过脱分化产生愈伤组织培养途径是否会引起不良变异， 丧失原品种的优良性状，取材亦受季节影响，器官的生理状态和生育年龄，材料大小的影响，茎尖 培养存活临界大小应为一个茎尖分生组织带有 1~2 叶原其，大小为 0.2~0.3mm,叶片、花瓣等约为 5mm2,茎段则长约 0.5mm，甘蔗心叶愈伤组织中，5mm左右； 第二，选择好合适的培养基激素及其

他添加物；第三，注意掌握适宜的培养条件，如光照、温度、湿度。 1．光 光因素包括日照长度，辐射强度，光源（波长）

（1）光照长度（光周期）——对此问题了解得很少，常用的日长即选用 14~16 小时，虽然也有连续 光照的，不同培养物对日长要求有时很严格，如需暗萌发的种子要求在连续黑暗中才能萌发，需光 萌发种子必须有光照。有的植物进行休眠或开花，必须选择特定的日长范围。

（2）辐射强度——培养瓶内的培养物不能采用像田间或人工气候室那么强的光照（30~70Wm2）通

－

常用 8~15Wm的光照。

（3）光源（波长）——红光能促进生长和分化 2．温度

培养室内常用温度 24~26℃，25±2℃一般低于 15℃培养的组织生长出现停滞，高于 35℃的生长 也不利，促进芽的温度略低于增殖苗的温度一般恒温。 3．湿度：培养容器内的相对湿度几乎达到 100%，而环境中的温度会影响培养基湿度一般要求 70%~80%的相对湿度。

4．气体的影响：试管苗生长和繁殖需氧气，液体培养需进行振荡或浅层培养以解决供氧问题。 三．技术过关

要建立初代培养，操作技术亦十分重要，无菌操作快，动作熟练，缩短可能污染的时间。