牛奶和乳制品中唾液酸的测定 - 图文

的结果较为合理（如：基于HorRat的结果，唾液酸的中间重现性为0.97），但是在这项研究中，与从其他样品获得的数据相比，还是很不理想。这说明对酸奶来说，我们对它的处理还有提升的空间。 实验结果：

①在牛奶和配方奶粉方面的应用：

我们用优化的方法对牛奶和婴儿配方奶粉的样本进行了优化。尽管不能直接应用于液体牛奶，但是该方法已确认对奶粉和含奶饮料（溶解）有效，因此对牛奶样本的分析来说不会引进新的问题。同样的，因为婴儿配方奶粉和成长牛奶之间非常相似，对成长牛奶的分析来说不会有新的问题。我们从当地杂货店买的经巴氏消毒法消毒的牛奶，山羊奶和绵羊奶，并从中获得相应的样本。通过已知方法（Table10）对每种样本进行重复的分析。发现Neu5Gc的含量在牛奶中的含量最低（5mg/kg），在绵羊奶中的含量最高（214mg/kg）。相反，Neu5Ac在牛奶中的含量最高（185mg/kg），在山羊奶中的含量最低（20.2mg/kg）。牛奶中唾液酸的检测值（假设只有Neu5Gc和Neu5Ac）与Neeser和他的同事及Morrissey先前得到的值相似。不过，这个结果要比Tang和他的同事, Puente 和他的同事及Kargin Kiral和他的同事得到的结果高得多。Puente 和他的同事从山羊奶中得到唾液酸含量（180-240mg/kg）要稍高于我们研究的结果（170mg/kg），不过两组数据之间还是具有可比性的。相似的，Morrisey得到的哺乳期后期的山羊奶中唾液酸的浓度水平（175mg/L）与我们得到的数据相似。目前我们所了解的是，哺育，营养的摄取和气候的不同会影响牛奶中唾液酸的组成。不过，牛奶中唾液酸的含量由于不同的方法而造成结果的不同也需要进行考虑。对奶制品制造商而言，唾液酸含量的多少已经成为需要考虑的重要因素。

大量的婴儿配方奶粉和成长奶粉从Nestlé Nutrition (Vevey, Switzerland)中获得，当然也包括其他竞争者的产品。含唾液酸的产品通过我们的方法进行测量后，唾液酸的总量是由Neu5Ac和Neu5Gc量的和得出，各唾液酸的量见Table10。Neu5Ac的量一般为唾液酸总量的96%，与牛奶中唾液酸的含量相似。不同产品中唾液酸的含量范围是96mg/kg-261mg/100g，与Table1中的数据相符。产品A的唾液酸含量最高，是我们唯一对初乳配方进行分析的数据。我们可以看到，初乳

中的唾液酸的浓度水平很高。

唾液酸将会成为一种广受关注的营养物质。对制造商们而言，他们需要对他们含唾液酸的产品中的唾液酸进行可靠，有效地分析。他们也需要一种受到认同的方法去帮助他们对自己的产品进行改进，对自己产品中的唾液酸进行量的控制。同样，一般实验室也需要相似的方法去确认他们所分析产品的标识。这种方法将会满足奶制品工业的需要。

Table10：牛奶和配方牛奶中唾液酸的分析

②结论：

我们改进了Hara和他的同事的方法，并证实该方法在奶制品中对Neu5Ac和Neu5Gc的检测有效。同时我们对色谱条件也进行了相应的改进，两种唾液酸在快速解析HPLC色谱柱中2min内即可分离，分离的总时间为7min（包括重新对色谱柱进行洗脱和平衡）。当使用USP提供的标准物时，没有进行水解的唾液酸的回收率置信区间为95%，比进行水解的回收率低5-6%。在奶制品中，回收率的范围在87%-108%之间，其扩大的相对不确定度在?4.2-?19%之间。 评述： ①综述：

为了让大家更好的了解这篇论文，我再对这篇论文进行一个小结。首先这篇论文作者的目的是使用一种灵敏的方法对奶制品中的唾液酸（Neu5Gc和Neu5Ac）进行即快速，又灵敏的检测。他在前人的基础上(主要是Hara和他的同事)，对

HPLC分离Neu5Gc和Neu5Ac进行了改进。

作者通过对十二种不同类型的色谱柱的综合比较，以色谱柱的层析效能和流动相的流动速度为评判标准，最终决定使用Zorbax SB-Aq(4.6×50 mm, 3.5 μm)为该方法的色谱柱。同时作者通过酸水解和酶水解的对比，在两者水解唾液酸结合物的时间长短，水解后唾液酸的状态及唾液酸水解释放的比例等综合因素，选择用酸水解来进行。随后作者又将酸水解中的乙酸水解，硫酸水解，甲酸水解的方法进行比较，最终选择水解速度快，唾液酸回收率高的甲酸水解法。接着作者又对目前常见的两种唾液酸的衍生方式（OPD衍生反应和DMB衍生反应）进行对比，最终在衍生反应的时间，与HPLC的搭配及衍生物的稳定等方面选择了DMB在80?C，50min对唾液酸进行衍生。

最后，为了对自己的方法的可靠性进行判断，作者对自己实验的重复性和中间重现性的结果与以往的数据进行了比较，又通过RSD(r)及RSD(iR)，回收率和不确定度的，证明了数据的可靠性。

作者在这一系列的对比和论证后亲自用自己的方法对一些奶制品进行了分析，通过对以往数据的对比和各种因素的讨论，证明了自己方法是有效而又灵敏的，也对自己的方法应用于奶制品工业充满了信心。 ②该研究的优点：

<1>首先，我们可以看到作者在这项研究中的严谨，作者通过不断地举例对比，将以往使用HPLC方法分离分析唾液酸的方法的每一步，几乎都进行了优化，可见该研究的深入及彻底。 <2>色谱柱的选择：

这项研究的其中一个优点就是选择了合适的色谱柱，不仅柱效良好，而且色谱分析的时间得到了很好的优化。

通过新型色谱柱的应用，流动相在其中的流动速度能达到2ml/min，唾液酸在HPLC中的分离时间缩短至7min。而之前Hara及他的同事所用的色谱柱<ⅰ>TSK gel ODS-120T分离时流动相的速度只能达到0.9ml/min。

同时作者在选择色谱柱对流动相的搭配和对被分析物的性质上，也恰到好处，ZORBAX SB系列的色谱柱有以下特性：“安捷伦ZORBAX StableBond柱采用专利的，

独特的单官能团硅烷，带有较大的二异丁基(SB-C18)或二异丙基(SB-C8，SB-C3，SB-Phenyl，SB-CN和SB-Aq)空间位阻侧链基团，保护关键的硅氧键在低pH条件下免受水解的进攻。为保证在酸性流动相条件下的稳定性，长寿命及重现性，StableBond填料不封端。由于高纯度，低酸性的硅胶对酸性、碱性以及中性化合物具有优异的峰形，从而使得StableBond柱成为在低pH开发方法时的首选色谱柱。ZORBAX StableBond柱与所有常用的流动相兼容，包括水含量很高的流动相。”。

作者在这里使用的几种流动相分别是：水/乙醇/乙酸(75:25:0.05, v/v/v), 水/乙醇/乙酸（80:20:0.05, v/v/v）, 含水乙醇（1:1，v/v），都可以很好的与ZORBAX SB-Aq兼容。唾液酸作为9-碳单糖的衍生物，可以使用反相色谱（流动相极性大于固定相极性）的方法对其进行分离，同时唾液酸又是偏酸性的，因此Zorbax SB系列（包括SB-Aq）的色谱柱均可以很好的满足对它的分离分析。

作者随后对这一类型的色谱柱对分离唾液酸的柱效进行对比，最终选择了Zorbax SB-Aq作为色谱柱。正确的选择色谱柱对他的研究目标（快速灵敏的对唾液酸进行分析）的达成起了不小的作用。 <2>用甲酸对唾液酸结合物进行水解：

我认为该研究中最大的优点就是使用甲酸进行唾液酸结合物的水解。从最近一篇综述中可以看到，酸水解中的几种主要方法是：25mM HCl,25mM三氟乙酸(TFA), 25mM硫酸和2M乙酸。但是这几种物质会造成很大的损失，有的甚至会造成20%的损失，并且水解花费的时间较长，远不如酶水解的方式有效。 虽然也有文献介绍过甲酸作为一种酸水解的方式很有效<ⅲ>,但是一般认为甲酸水解，唾液酸达不到很好的释放量。

而作者根据这几种酸对唾液酸水解的回收率，水解时间及水解时唾液酸降解的量，发现对成长奶粉（Nestlé Excella Gold）这种模式样本来说，甲酸只需1h的水解就可达到比起他酸水解更好的最大回复率，同时甲酸对唾液酸造成的损失又比其他方法酸水解造成的损失小，从这几个方面看，甲酸对唾液酸的水解效果与其他酸水解唾液酸相比，优势很大，比起水解效果很好的唾液酸酶，也丝毫不逊色。同时，研究还发现，经过甲酸水解，2h后，回收率只是略有下降，且唾液