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其运动的时间为7min,因此我们可以在几小时内完成一系列被分析物的分析,而不用担心DMB衍生物发生变化。 <4>方法的正确性检测:
对色谱柱中Neu5Ac检测的线性范围是0.12-4.8ng,对Neu5Gc检测的线性范围是0.02-4.5ng。两者的校准曲线可以见Fig.4
Fig.4:一般方法校正曲线的线性范围
方法的准确性是由实验的重复性和中间重现性体现的(Fig.5)对Neu5Ac,除酸奶的重复性的相对标准偏差(RSD(r))为7.22%外,其余RSD(r)小于2%,除粉末冲剂饮料的中间再现性的相对标准偏差RSD(iR)为3.58%和酸奶的RSD(iR)为6.79%外,其余RSD(iR)均小于3%。对Neu5Gc,除酸奶的RSD(r)为7.94%外,其余的RSD(r)在3.2%以下,除酸奶的RSD(iR)为6.45%和液体冲剂饮料的RSD(iR)为9.31%外,其余的RSD(iR)均在5.5%以下。唾液酸是由Neu5Ac和Neu5Gc的总量和表示。数据的统计分析发现Neu5Ac是所有的产品中唾液酸的主要成分(通常95%以上)。和其他的研究者的数据相比,我们的数据有很好的准确性:Hara和他的同事得到Neu5Ac标准物的RSD(r)值在3%-5%之间,Neu5Gc标准物的RSD(r)值在2%-5%,Stanton和他的同事分析从糖蛋白游离出的Neu5Ac的RSD(r)为5.1%。Martin和他的同事通过分析奶制品(婴儿配方奶粉)得到的唾液酸的正确性检测的数据显示,Neu5Ac的RSD(r)的值为2.7%-4.8%,RSD(iR)为4.4%(未检测Neu5Gc)。
很难有恰当的方法获得实验的准确性数据(回复值)。理论上,使用能与唾液酸结合的很好的材料做基准物质。可是,这样一种基准物质并不存在。USP提供了两种结合唾液酸的物质:Neu5Ac和Neu5Gc。我们已知其中游离唾液酸的含量并分别对这些物质在水解和未水解的状态下进行分析。未水解的情况下,我们能得到极好的回收率,其中Neu5Ac是95%,Neu5Gc是100%。充分有力的数据表明没有一个值与100%有显著地差异。相反,水解后,Neu5Ac的回收率下降到90%,Neu5Gc的回收率下降到94%。这些数据表明水解后的唾液酸回收率与100%有显著性差异。
通过同位素示踪法对从食物中回收到的唾液酸进行检测,我们共检测了三种水解后游离唾液酸的浓度水平(Table6-8)。通过USP提供的理论数据,我们发现回收率大体与100%有显著性的差异,Neu5Ac回收率的范围是87%-102%,Neu5Gc是90%-108%,两者总和的范围是87%-102%。和Martin和他的同事的回收率数据进行比较,Martin得到的婴儿配方奶粉(与成长奶粉相似)中Neu5Ac的回收率范围为98%-103%,与目前的方法得到的范围96%-101%相似。在以大豆为主要成分的饮品中,回收率也很相似,Martin和他的同事的得到的回收率为97%-99%,
目前的方法得到的回收率为95%-98%。在乳清蛋白浓缩物的样本(WPC)中,同位素示踪法显示其回收率很低。这可能主要是由于回收实验中的设计原因。WPC中的唾液酸的浓度很高(9210mg/kg)。因此,为了在检测器的检测范围内保留WPC处理后的样本和保持唾液酸的最终浓度水平,示踪同位素法的水平与天然唾液酸的浓度相比需要足够的低(天然唾液酸的20%,40%和60%被同位素标记)。而对另一种样品来说,当天然物的浓度越低,而示踪同位素法的标记程度越高,回收率就越好。
Table6:Neu5Ac的回收率
Table7:Neu5Gc的回收率
Table8:唾液酸的回收率
Table9:测量的不确定度
测量的不确定度是由Barwick和Ellision通过将中间重现性和回收实验结合而得到的数据(Table9)。对于Neu5Gc的检测,除了液体冲剂饮料中的不确定度为?18.9%,其余样品中Neu5Gc的检测的不确定度在?15%以下。大部分样品中Neu5Ac的检测的不确定度在?10%以下(除WPC和酸奶外)。对结合状态的唾液酸来说,其不确定度会有所扩大。而对WPC来说,回收率是其不确定度扩大的主要因素,正像前面提到的,很可能这是由于回收试验的设计所造成的。而对于酸奶来说回收率和中间重现性是不确定度扩大的重要原因。尽管酸奶进行实验后得到
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