分子遗传学 - 图文

D．分子量小，以容纳较大的外源DNA； E．具生物安全性。

③外源DNA片断和载体的连接 A．粘性末端连接

方式：(1)同一限制酶切位点连接

目的基因用Bam HⅠ切割GCCTAGGCCTAGGGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG载体DNA用Bam HⅠ切割+GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGGGATCCGGATCCGGGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG

载体自连 (2)不同限制酶切位点连接

配伍末端连接（与同种限制酶切相似） 非配伍末端连接

重组体目的基因自连

EcoRⅠ+ BglⅡ双酶切AATTCGATCTAGAATTCGGATCTAEco RⅠ+ BglⅡ双酶切+AATTCGATCTAG

T4DNA连接酶15oCGAATTCCTTAAGAGATCTTCTAGA重组体B．平端连接

适用于：限制性内切酶切割产生的平端 粘端补齐或切平形成的平端 C．同聚物加尾连接

在末端转移酶(terminal transferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。

3）用重组DNA分子转化受体细胞，并能在受体细胞中复制和遗传； ①受体菌条件：

安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷

处于感受态(competent)

感受态细胞：受体细胞经处理后处于最适摄取和容忍重组体的状态。 ②导入方式：

转化 (transformation)：通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为转化作用。

转染 (transfection)：当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（供体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用。 转染 (infection）：是特殊形式的转化，是离体状态的完整的病毒噬菌体DNA/RNA感染受体菌而引起的后者遗传型和表型发生的变化。 4）对转化子筛选和鉴定； ①筛选

抗药性标记选择：抗四环素标记

标志补救(marker rescue)：蓝白斑筛选 分子杂交法：原位杂交 Southern blot

5）对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。

重组DNA技术操作过程总结：

分

分离目的基因

切

限制酶切目的基因与载体

接

拼接重组体

转

转入受体菌

筛

筛选重组体

2.PCR技术：聚合酶链式反应（polymerase chain eaction,PCR ）

1) 原理：模拟体内DNA复制条件，应用DNA聚合酶反应，特异性扩增某一DNA片段。 2) 反应体系：DNA模板，引物，dNTP，Taq DNA聚合酶，buffer 3) 反应程序： 变性 ( 94~95oC)

退火 延伸

( 37~55 oC) ( 70~72 oC ) 72 oC延伸10min

30-35cycles DNA扩增100万倍

优点：（1）特异性强、灵敏度高、稳定可靠、快速； （2）微量的模板DNA即可扩增大量产物。 应用：（1）基因组DNA分析；

（2）遗传物质的鉴定； （3）遗传病的诊断。 缺点：（1）需靶DNA序列的信息；

（2）产物短小，DNA复制不精确。 3基因文库：

1）基因组DNA文库：将某一基因组DNA用适当的限制酶切断后，与载（质粒或噬菌体）体DNA重组，再全部转化宿主细胞，存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合称为G文库

2）cDNA文库(cDNA library)：以某种细胞的全部mRNA为模板，利用逆转录酶合成与mRNA互补的DNA（cDNA）再复制成双链cDNA,与适当的载体连接后转化入受体菌，得到含全部表达基因的种群，称为C-文库(cDNA library)。（具有组织特异性） 4.分子杂交技术

分子杂交（molecular hybridization）：标记的探针DNA变性后与变性后的靶DNA/RNA通过碱基互补配对结合，形成杂种分子的过程。 分子杂交包括：

DNA-DNA杂交（Southern blot）; DNA-RNA杂交（Northern blot）; 蛋白-蛋白杂交（Western blot）。 基因探针（probe）：是指与一段目的基因或DNA/RNA片段特异杂交的核苷酸序列。可以是整个基因，或是基因的一部分，是DNA，也可以是RNA。 1）探针标记

同位素：32P , 35S , 3H-dNTP等；

非同位素：地高辛-dNTP ，生物素-dNTP。 2）探针制备方法

缺口平移法（Nick translation） 随机引物法（Random primer） 末端标记法（Random primer）