第十二章 核酸和蛋白质的生物合成(dna)

15.[ ]参与直接修复DNA分子上6-甲基鸟嘌呤这种异常碱基的甲基转移酶可直接将鸟嘌呤上的甲基转移到它的哪一种氨基酸残基上？ A.Lys B.His C.Cys D.Pro E.Met

16.[ ]预测下面哪一种基因组在紫外线照射下最容易发生突变？ A.双链DNA病毒 B.单链DNA病毒 C.线粒体基因组 D.叶绿体基因组 E.细胞核基因组

17.[ ]将两段寡聚脱氧核苷酸片段5′-ACCACGTAACGGA-3′和5′-GTTAC-3′与DNA聚合酶一起加到含有dATP、dGTP、dCTP和dTTP的反应混合物之中，预测反应的终产物被参入的各碱基的比例是 A.2C∶1T B.1G∶1T C.3G∶2T D.3G∶3T∶2C E.5T∶4G∶3C∶1A

四：问答题

1.什么是DNA聚合酶的进行性？如何测定一种DNA聚合酶的进行性？ 2.如何证明DNA复制延伸的方向是从5′→3′？

3.在冈崎提出DNA复制的不连续性观点以后，对于DNA复制过程中是两条链都是不连续复制，还是仅仅是后随链才是不连续复制，存在着很大争议。显然前导链的合成不需要不连续复制，但是许多研究者发现经脉冲标记的冈崎片段可以和亲代DNA的两条链杂交，这似乎意味着亲代DNA的两条链都可以作为冈崎片段的模板。试提出一种机制解释前导链的复制也可能产生冈崎片段，并设计一个实验证明你提出的机制。

4.DNA连接酶在AMP存在的情况下能够解开超螺旋的环型DNA，而在缺乏AMP的情况下并不具有这种功能。（1）试解释这种反应的机制，为什么该反应依赖于AMP？（2）如何确定一个超螺旋的DNA分子已被解开？

5.四环双萜(Aphidicolin)是DNA聚合酶α的特异性抑制剂，尽管它并不是NTP的类似物，但抑制动力学表现的是竞争性特征。通常对四环双萜呈抗性的细胞突变株是因为DNA聚合酶α结构上的变化而引起的。然而某些对四环双萜呈抗性的突变株细胞的DNA聚合酶的结构并无变化，而核苷二磷酸还原酶的结构则发生变化。试解释核苷二磷酸还原酶的结构的变化是如何导致突变的细胞对四环双萜有抗性的？ 6.已发现大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的3′→5′的外切酶活性并不能区分3′端错误配对的核苷酸和正确配对的核苷酸。3′-端正确配对的核苷酸和错误配对的核苷酸可被相同的速度切下。你如何解释这种观察到的结果与3′→5′的外切酶活性提高复制的忠实性这一事实不相冲突。

7.为什么到现在为止还没有得到在所有温度下都缺乏5′→3′的外切酶活性的DNA聚合酶Ⅰ的突变株？

8.请设计一个实验证明野生型的大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ在催化DNA复制的过程中具有自我校对的能

力。

9.试解释为什么象应？

10.简述维持DNA复制的高度忠实性的机制。你预计前导链复制的忠实性与后随链复制的忠实性会是一样吗？

11.大肠杆菌dnaA蛋白的突变通常是致死型的。对于这种蛋白质功能的研究只能借助于条件致死型突变株。已得到大肠杆菌的一种温度敏感型突变株。这种突变株在18℃能生长的很好，其DNA能正常地进行复制，但在37℃就不能正常地生长，这时候，DNA不能进行复制。有两种结果在确定dnaA蛋白的功能中很有用：其一是体外进行的研究表明使用缺刻的DNA模板不需要dnaA蛋白；其二是将生长在18℃下的突变株放在37℃下培养，DNA复制会继续进行，直到一轮复制结束，以后DNA复制将停止。你从以上观察 中，对dnaA蛋白的功能有什么结论？

12.大肠杆菌染色体DNA的长度为1.28mm。在最适的条件下，DNA复制一次约需要40分钟(1)在1分钟内，一个复制叉前进的距离是多少？(2)如果复制的DNA以B型DNA存在(10.4bps/turn)，则在一个复制叉内，每分钟有多少核苷酸参入到新合成的链之中？(3)大肠杆菌细胞分裂的时间大约只需要28分钟，那么在28分钟内如何完成子代DNA的复制？(4)如果人的培养细胞(如Hela细胞)DNA的总长度为1.2m,S期持续的时间为5个小时,而复制叉前进的速度为大肠杆菌复制叉前进速度的1/10,则每一个人细胞中约含有多少个复制起始区?(5)以上相连的复制区之间的距离有多少千碱基对(kbps)?(6)什么因素能够保证多个冈崎片段之间按照正确的顺序组装在新合成的DNA链上？

13.脊椎动物细胞和植物细胞的DNA上的胞嘧啶经常被甲基化形成5-甲基胞嘧啶。在相同的细胞内，发现有一种专门的能够识别错配G-T碱基对并将它们修复为正常的G-C碱基对的修复系统。你认为这种系统存在于含有5-甲基胞嘧啶的DNA的细胞中有什么样的合理性。

14.在大肠杆菌DNA分子进行同源重组的时候，形成的异源双螺旋允许含有某些错配的碱基对。为什么这些错配的碱基对不会被细胞内的错配修复系统排除？

15.dUTPase或DNA连接酶活性有缺陷能够刺激重组的发生。为什么？

答案：

1. DNA聚合酶 引发酶 解链酶 单链结合蛋白 拓补异构酶 DNA连接酶 切除引物的酶 2. 5’ 3’

3. DNA聚合酶I RnaseH MF1 4. OriC ARS A-T 解链 5. NAD+ ATP

6. DNA聚合酶I DNA连接酶 7. RNA 人工合成的DNA

8. 胰蛋白酶 枯草杆菌蛋白酶 Klenow 3’→5’核酸外切酶 DNA聚合酶 5’→3’核酸外切酶 9. DNA聚合酶III 不对称 前导链 后随链 环（loop） 10. 1 2 Tyr

11. 碱基损伤 DNA链损伤 理化因素 生物学因素 12. FADH2 蝶呤 脱氮黄素 嘧啶二聚体 13. P53 阻止 细胞凋亡

14. DNA糖苷酶 AP内切酶 DNA聚合酶 DNA连接酶 15. DNA聚合酶的高度选择性 DNA聚合酶的自我校对 错配修复

16. 同源重组 位点特异性重组 位点特异性重组需要特异性的蛋白质识别重组位点 17. 链的入侵与分支的迁移 异构化与Holliday连接的分离 18. DNA聚合酶III

噬菌体所具有的线形DNA不能被仅由大肠杆菌编码的复制蛋白催化完成复制反

19. 原核DNA拓补异构酶 真核DNA聚合酶α 20. RNA 蛋白质 维持端粒DNA的完整 21. SV40 22. 长 二 是非题

1. 错 对于一个双向复制的DNA分子来说，相对于一个复制叉为前导链的那条链相对于另一个复制叉来说则是后随链的模板。

2. 错 DNA复制的忠实性主要是由DNA聚合酶的高度选择性决定的，DNA聚合酶所具有的3’→5’核酸外切酶只是进一步提高复制的忠实性。

3. 错 Ribozyme是以RNA为生物催化剂，在端聚酶分子中，RNA仅仅作为模板，发挥催化作用的是其蛋白质部分。 4. 对

5. 错 大肠杆菌DNA聚合酶以NAD+作为能源物质，并非氧化剂。 6. 错 滚环复制的后随链合成仍然需要RNA引物。

7. 对 D环复制的两条子链的合成都是连续的，因此不形成冈崎片段。

8. 错 在真核细胞细胞核DNA复制的过程中，会发生DNA聚合酶α被δ取代的过程，DNA聚合酶δ

具有校对功能，因此真核细胞细胞核DNA复制的忠实性并不比原核细胞差。 9. 对 SSB能够与DNA单链区域结合，稳定单链状态，因此能够降低Tm。 10. 错 DNA的延伸速度相对恒定，与培养基的营养状况关系不大。 11. 错 参与大肠杆菌DNA错配修复的DNA聚合酶为DNA聚合酶III。

但是具有甲基转移酶，甲基转移酶是参与直接修复异常甲基华的碱基的。12. 错 虽然人类没有光复活酶， 13. 错 多功能酶一般指一条多肽链同时具有多个不同酶的活性，DNA聚合酶III虽然具有多个酶的活性，

但是各个酶的活性由组成它的不同多肽链承担，因此它不能算是多功能酶。

14. 对 癌细胞具有无限的增值能力，而正常的细胞寿命是有限的，这与端聚酶的活性是平行的。 15. 错 真核细胞通过甲基化调节基因的表达，并不是以此作为错配修复时识别老链和子链的标志。 16. 对

17. 错 DNA在合成时，不断发生连接反应，将先形成的冈崎片段连接起来，并不是在反应的最后才将

各冈崎片段连接起来。 18. 对

19. 错 当DNA聚合酶I因突变缺失其聚合酶活性或3’→5’外切酶活性的时候，大肠杆菌还能成活，但

是当因突变倒是其5’→3’外切酶活性丧失的时候，RNA引物将无法切除，冈崎片段因此将不能连接起来，这种突变必然是致死型突变。 20. 对

21. 错 DNA聚合酶I通过5’→3’外切酶活性参与DNA复制过程中RNA引物的切除。 22. 错 现已发现lexA蛋白是在Rec A蛋白的激活下，自我切割。 23. 对

24. 错 真核细胞DNA复制过程中复制叉前进的速度（30核苷酸/秒）实际上小于原核细胞DNA复制叉

前进的速度（1000核苷酸/秒），但是，真核细胞DNA具有多个复制起始区，这就弥补了复制叉前进速度低的不足。

25. 错 重组修复只能将嘧啶二聚体从一条链转移到另一条链，并不能根除嘧啶二聚体。

26. 错 T7噬菌体的DNA是线形的，宿主细胞原来的复制系统并不能解决线形DNA复制所遇到的末端

的问题。 四 单选题

1.C 2.D 3.A 4.A 5.C 6.E 7.A 8.D 9.B 10.A 11.D 12.D 13.C 14.B 15.C 16.B 17.C

五 问答题

1. 答：DNA聚合酶的进行性是指某一种DNA聚合酶在催化聚合反应中，从酶与模板结合到与模板解离

的这段时间内，催化了多少核苷酸的参入。测定某一种DNA聚合酶的进行性，可先让酶与模板结合并进行聚合反应，然后迅速加入大量的非特异性DNA，当DNA聚合酶从模板上解离下来以后I，由于大量的非特异性DNA稀释了原来的DNA模板，使得DNA聚合酶很难再与原来的模板结合，这样就得到了新合成的DNA片段，通过凝胶电用可大概知道片段的长度。

2. 答：将双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）加到体外复制体系中，如果能够造成末端终止，则DNA复制的方

向是5’→3’，因为当DNA复制是3’ →5’时，ddNTP无法参入到DNA链的生长端（无3’-羟基，不能与前一个核苷酸形成3’，5’-磷酸二酯键），即5’端，因此不可能造成末端终止。

3. 答：前导链似乎也形成小的片段，是因为在一个细胞中，含有微量的dUTP，它在DNA复制过程中，

有可能代替dTTP参入到新合成的子链中，由于脱氧尿苷酸不是DNA分子中的正常核苷酸，所以体内的修复系统会将它去除。去除的机制先是尿嘧啶糖苷酶切除DNA链上的尿嘧啶，然后AP内切酶在被切除碱基的地方，将DNA链切开，外切酶切除一段包括错误ide尿苷酸在内的核苷酸序列，再由DNA聚合酶和连接酶完成剩下的修复工作。AP内切酶的作用必然导致前导链形成小的DNA片段（类似于冈崎片段）。筛选AP内切酶缺失的大肠杆菌突变株，观察以上现象是否还能发生。

（1）在有高浓度的AMP的存在下，DNA连接酶催化的连接反应会发生逆转，即DNA连接酶催4. 答：

化连接反应的逆反应的发生。在这时DNA链会出现缺口，超螺旋DNA内的张力得以释放，而转变成松弛型DNA。

（2）使用凝胶电泳法可以很容易地区分超螺旋DNA和松弛型DNA。

5. 答：既然四环双萜对DNA聚合酶α活性的抑制表现出竞争性特征，那么当它的底物（dNTP）浓度激

增的情况下，抑制作用就应该被解除。核苷二磷酸还原酶是催化NDP→dNDP的酶，它的活性通常受到严格的调控（主要是反馈机制），以维持细胞内dNTP在一个比较合适的浓度。如果此酶发生突变引起酶的活性调节机制失灵的话，则dNTP的量可能过分地产生。而过分生成的dNTP必然解除四环双萜对DNA聚合酶α的抑制。

6. 答：已发现DNA聚合酶I在催化错配的碱基的3’-端进行的眼神反应的速度低于在正确配对的碱基的

3’-端所进行的眼神反应。因而错配的碱基在3’-端暴露的时间就长，这就为3’→5’外切酶切除错配的碱基创造了更大的可能性。

7. 答：大肠杆菌DNA复制过程中合成的RNA引物由DNA聚合酶I所具有的5’→3’外切酶负责切除。

当DNA聚合酶I丧失其内在的5’→3’的外切酶活性以后，DNA复制中合成的RNA引物就不能被有效地切除，这必然导致冈崎片段的积累，新合成的DNA无法形成连续的链。这样的突变株是无法繁殖生存的。所以到现在为止，还没有得到在所有温度下都缺乏5’→3’的外切酶活性的DNA聚合酶I的突变株。

8. 答：以人工合成的poly dA为模板，以3’端为[P32]-dCMP的Oligo[H3]-dT作为引物，加入DNA聚合酶

I。引物中的dT将会与模板中的dA正常地配对，而引物中的最后一个核苷酸dC将不会与dA正常地配对。在dTTP存在下，会发现引物中的[P32]标记的dCMP很快地消失，而[H3]标记的dT不仅没有消失，而且还有增加。这说明DNA聚合酶I依靠它的3’→5’的外切酶活性去除了错误的dCMP，然后根据模板的要求继续进行复制。

9. 答：T7噬菌体的基因组DNA是线形的，而它的宿主细胞（大肠杆菌）DNA是环形的。线形DNA复

制会遇到一个很特殊的问题：在它的DNA复制的过程中，当与两端互补的RNA引物被切除后，由于DNA复制的方向只能是从5’→3’，所以必须有一种机制保证引物切除后留下的空缺能够得以填补，否则它的DNA每复制一次，就缩短一段核苷酸序列。因此如果单靠大肠杆菌编码的复制蛋白是无法完成它的DNA复制的。

10. 答：维持DNA复制的高度忠实性的机制主要包括：

（1） DNA聚合酶的高度选择性。

（2） DNA聚合酶所具有的3’→5’的外切酶活性能够进行自我校对，以切除复制过程中错误参入

的核苷酸。

（3） 错配修复。

（4） 使用RNA作为引物也能提高DNA复制的忠实性。因为当DNA刚开始进行复制的时候，由

于缺乏协同性，所以错误的机会很大。利用RNA作为引物，就可以降低在开始阶段所发生的错误，这是因为最终RNA引物都要被切除。如果不使用RNA作为引物，那么后随链的合成忠实性可能要低于前导链。

11. 答：dnaA蛋白的功能参与DNA复制的起始，负责识别复制起始区。在体外使用缺刻的DNA模板不

需要dnaA蛋白，这是因为缺刻DNA很容易解链，缺刻处可直接作为复制起始区使用；将生长在18℃下的dnaA蛋白的突变株放在37℃下培养，DNA复制会继续进行，直到一轮复制结束，以后DNA复制将停止。这是因为在18℃下，当将细胞改放在37℃dnaA蛋白具有活性，DNA复制能够正常地起始。下培养，原来与已完成起始步骤的DNA可继续复制直到结束。然而却不能进行新一轮的复制，因为在37℃下，dnaA蛋白没有活性。 12. 答：

（1） 1.28/40/2=0.016mm （2） 9.748×104核苷酸

（3） 因为在原核细胞内，第一轮DNA复制还没有完成以前就可以从复制起始区进行第二轮复制。 （4） 1250复制区（2500）复制叉。 （5） 2927千碱基对。

（6） 后随链在合成过程中，相恋的冈崎片段不断地连接起来，而不会发生于模板解离的现象。这

就保证了多个冈崎片段之间按照正确的顺序组装在新合成的DNA链上。

13 答：5-甲基胞嘧啶可自发地发生脱氨基作用而转变成T。如果这种情况在细胞中发生，则原来正常的

G-C碱基对就变成了错配的G-T碱基对。假如这种错配的碱基对得不到纠正，则经过一轮DNA复制，原来的GC碱基对有可能转变为At碱基对。如果细胞内有一种专门的能够识别错配G-T碱基对并将它们修复为正常的G-C碱基对的修复系统，则可以避免上述情况的发生。

14 答：大肠杆菌在进行错配修复的时候，根据老链和新链的甲基化程度不同而识别出新链上错配的碱基，

再将新链上错误的碱基切除，而不会切掉老链上正确的碱基。在DNA进行同源重组的时候，形成的异源双螺旋尽管会含有某些错配的碱基对，但异源双螺旋的两条DNA链上都是高度甲基化的，因此这些错配的碱基对不会被细胞内的错配修复系统排除。

15 答：DNA重组首先需要DNA链发生断裂。如细胞内的dUTPase活性有缺陷，则细胞内的dUTP的浓

度就比较高，在DNA进行复制的时候，dUTP代替dTTP参入到子链中的可能性就大大提高，而细胞内的碱基切除修复系统会识别错误参入的尿苷酸，在切除修复的时候，需要将DNA链切开。显然dUTP参入的机会越大，DNA链断裂的机会就越大，因而重组的可能性就提高。如果DNA连接酶活性有缺陷，同样会使DNA链断裂的机会提高，所以同样能够刺激重组的发生。