各种实验操作

生物）细胞破壁方法是：自溶法，即将菌体放在适当的pH值和温度下，利用组织细胞自身的酶系将细胞壁破坏，使细胞内的物质释放出来。自溶时需加少量防腐剂，以防外界细菌污染。自溶法的缺点是时间较长。 2、3，5-二硝基水杨酸比色定糖的原理

（1）DNS试剂+ D-葡萄糖 氨基化合物

（还原糖） （棕红色）

（2）在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度成一定比例关系（可用于比色测定），所以可用DNS比色法测定还原糖的含量。 （3）该方法是半微量定糖法，操作简便、快速、杂质干扰较少。

三、试剂与器材 恒温水浴、自动部分收集器、恒温箱、梯度洗脱装置、冰箱、层析柱、分

析天平、电磁搅拌器、秒表、离心机、可见分光光度计、冻干机、沸水浴等。3,5二硝基水杨酸试剂(DNS)、5%的蔗糖溶液、1mol/L的 NaOH溶液、乙酸钠、0.2mol/L,pH4.6的醋酸缓冲液 6. 乙酸乙酯

四、操作方法① 细胞破壁→抽提→两次乙醇分级→透析→装柱→洗涤→洗脱→收集酶活力

峰→制冻干粉

② 制作3，5—二硝基水杨酸比色定糖法的标准曲线并测定三种酶样品的活

力

③ 测定三种酶样品的蛋白浓度

④ 计算各步酶样的比活力、提纯倍数和收率

⑤ 用双倒数作图法测定蔗糖酶的Km值 五、关键步骤与注意事项

① 乙醇分级时，注意低温、防止乙醇局部过浓，离心后要迅速溶解酶样 ② 装柱均匀，无截面、无气泡，床面平整，柱体垂直

③ 分离提纯的全过程中，防止酶失活并用测定酶活力的方法跟踪酶的去向

④ 在测定米氏常数时，将酶样溶解后一定要稀释到合适的浓度。 ⑤ 酶活力测定及作图一定要准确。 六、思考题

1、简述蔗糖酶分离提取的原理及操作步骤。

2、3，5-二硝基水杨酸比色定糖法的原理及操作注意事项。 3、用723分光光度计制作工作曲线的要求。 4、蔗糖酶活力测定的原理及两个反应。

5、在酶分离提纯的整个过程中应注意的一个关键问题是什么

实验题目：用正交实验设计法测定几种因素对蔗糖酶活力的影响

实验类型：基础 学 时： 8 一、实验目的 初步掌握用正交表设计实验方案并用数理统计方法处理实验数据

的步骤和注意事项。

二、实验原理 酶的催化作用受多种因素的影响。欲求某因素对酶活力的影响，通常是固定

其它因素，测定该因素不同水平下的酶活力。这是将多因素化为单因素处理的简单比较法。

三、试剂与器材 分光光度计、恒温水浴、秒表、沸水浴等。DNS试剂、pH4.6 0.2ml/L 的

醋酸buffer、0.2mol/L蔗糖液、各种pH缓冲液

四、操作方法

① 讲授正交实验设计法的基础知识及使用注意事项

② 用正交表进行实验并对实验结果进行极差分析和方差分析 ③ 求出蔗糖酶的最适温度和最适pH值 五、关键步骤与注意事项

① 被考察因素以外的实验条件必须保持稳定

② 方差分析的计算要用电脑编程 六、思考题

1、设计试验方案时，应遵循的原则是什么？

2、正交试验设计法与简单比较法、全面试验法相比较，有何优缺点？

实验题目：亲和层析分离乳酸脱氢酶同工酶 实验类型：综合 学 时： 10

一、实验目的

学习亲和层析法制备乳酸脱氢同工酶的原理和方法；学习并掌握乳酸脱氢酶同工酶的测定方法和原理。 二、实验原理

利用辅酶及其衍生物、抑制剂或激活剂作为配基，通过“间隔臂”与活化的琼脂

糖凝胶载体共价偶联成亲和吸附剂，采用亲和层析法分离乳酸脱氢酶同工酶。

三、试剂与器材

1.试剂 5/ -AMP-8(6-氨基己基)胺、QT4、乙腈、溴化氢、碳酸缓冲液、NaCl溶液 、

4mol/L及1mol/LNaOH、磷酸氢二钾 — 磷酸二氢钾缓冲液、硫酸铵、尿素、

+

NAD—丙酮酸钠加成物亲和洗脱液。

2.器材 玻璃烧结漏斗，pH计、电磁搅拌器、摇床、紫外分光光度计、组织捣碎机、

冷冻离心机、层析柱、自动收集器、紫外监测仪、梯度混合器。

四、实验内容

1. 5/ -AMP-8(6-氨基己基)氨基Q T4亲和层析介质的制备 （1）配制配基溶液 配200mg

/

5-AMP-8(6-氨基己基)胺的水溶液；（2）预处理QT4 NaCl洗涤，抽滤成饼状；（3） 活化QT4 ；（4）偶联

2.亲和层析分离LDH（1）制备组织提取液：制备猪骨胳肌及猪心的组织提取液；（2）

亲和吸附合并有活力的，测出为吸附的LDH活力；（3）亲和洗脱 留样测活，蛋白质含量计PAGE鉴定；（4）亲和介质的再生与保存

3.LDH活性测定 4.蛋白含量测定

5.PAGE鉴定LDH纯度 五、关键步骤与注意事项

测活时预先将丙酮酸溶液及NADH溶液放在25℃水浴中预热。操作时应注意酶的

稀释度及加入量，控制在△A340/min0.1-0.2之间。 六、思考题

1.亲和层析法的原理是什么？

2.分离乳酸脱氢酶同工酶的原理是什么？ 3.如何了解乳酸脱氢酶的活力和纯度？

实验题目：葡萄糖异构酶的固定化及活力测定 实验类型：综合 学 时： 8

一、实验目的

掌握酶的固定化方法及活力测定方法 二、试剂和仪器

熔砂漏斗、真空水泵、锥形瓶、恒温水浴、分光光度计 三、实验内容

载体的制备→酶的固定化→酶与底物的反应→咔唑法测定果糖含量→计算固定化酶的活力 四、关键步骤与注意事项

1. 对酶进行固定化时要注意缓冲液的pH，离子强度要适宜。 2. 由于葡萄糖溶液本身有碱异构的现象，所以以葡萄糖溶液为底物测定固定化葡萄糖

异构酶的活力时要作空白对照。 五、思考题

1. 什么是固定化酶？

2. 进行酶的固定化实验时有哪些要注意的方面？

实验题目：牛乳中蛋白的分离、纯化与鉴定

实验类型：设计 学 时：20 一、实验目的 1 从牛乳中提取酪蛋白，并对其进行纯化。 2 鉴定纯化后酪蛋白的纯度及酪蛋白的含量。

3学习新的实验方法，培养科学的实验作风。

二、实验原理 1 利用酪蛋白在其等电点时（ph=4.8）溶解度最小，使其等电点时沉淀，除

去其它蛋白质和脂类，得到粗产品，并利用其不溶于乙醇，初步纯化。 2用电泳技术将产品酪蛋白电泳带与标准酪蛋白的电泳带做对比可判断产品是否为酪蛋白。

3 利用SDS-PAGE法和分光光度法鉴定酪蛋白纯度。

4由于酪蛋白在其等电点（PH=4.8）时溶解度最小，又不溶 于乙醇，所以可用缓冲液调PH至4.8，用乙醇沉淀此产品。

三、试剂与器材 紫外分光光度计、离心机、水浴锅、电磁搅拌器、自动部分收集器、紫外

检测仪、梯度混合器、电泳装置、玻璃仪器等。

四、操作方法 牛乳→醋酸钠缓冲液→离心→洗涤（乙醚、乙醇）→进一步粗提纯→双缩脲

（紫外）测定→上柱→SDS电泳

五、关键步骤与注意事项

① 等电点调节准确

② 双缩脲测定含量不能超出曲线范围 ③ 上柱样量适宜,SDS上样量适宜

实验题目：紫外吸收法测定核酸含量

实验类型：基础 学 时： 4 一、实验目的 学习掌握用紫外吸收法测定核酸含量的原理和方法

二、实验原理 核苷、核苷酸、核酸的组成成分中都有嘌呤、嘧啶碱基，这些碱基全含有共

轭双键，它能强烈吸收250－280毫微米波段的紫外光。最大吸收在260纳米左右。

三、试剂与器材 紫外分光光度计、离心机等。钼酸铵－过氯酸沉淀剂、RNA或DNA干

粉、5％～6％氨水

四、操作方法 ① 绘制DNA在不同波长下的光吸收曲线 ② 测定并计算两种核酸样品的含量 五、关键步骤与注意事项

蛋白质和核苷酸影响测定，一定要排除 六、思考题 1、在绘制吸收曲线时应注意哪些？

2、说明使用分光光度计时，比色皿对所测样品的结果有无影响，该怎样处理？

实验题目：酵母RNA的提取及含量测定（地衣酚显色法）

实验类型：基础 学 时： 10 一、实验目的 （1）熟悉酵母RNA的提取方法

（2）掌握地衣酚显色法测定酵母RNA含量的原理和方法

二、实验原理 RNA与浓盐酸共热时，即发生降解，形成的核糖继而转变成糠醛，后者与3，

5-二羟甲苯反应呈鲜绿色，该反应需用三氯化铁和氯化铜作催化剂，反应产物在670nm处有最大吸收。RNA在20－250微克范围内，光吸收与RNA浓度 成正比。地衣酚反应特异性较差，凡是戊糖均有此反应。RNA和其他杂质也能给出类似的颜色。

三、试剂与器材 分析天平、恒温水浴、分光光度计、沸水浴等。0.2％氢氧化钠、乙酸、95％

乙醇、乙醚、地衣酚试剂

四、操作方法 ① 酵母RNA的提取

② RNA地衣酚法显色测定 ③ 数据处理及计算。 五、关键步骤与注意事项

该法反应特异性较差，凡是戊糖均有此反应。因此，测RNA含量时可先测定DNA的含量，再计算出RNA的含量 六、思考题

1、稀碱法提取的原理是什么？有什么优缺点？

2、提取RNA过程中为什么要严格控制时间、温度、pH值？

3、用学过的知识分析3种催化剂：FeCl3·6H2O,CuCl2·H2O和CuO，那种催化剂的催化

效果更好？

4、地衣酚反应中，干扰RNA测定的因素有哪些？如何能够减少它们的影响？

实验题目：氨基转移反应的定性鉴定

实验类型：基础 学 时：6 一、实验目的（1）学习一种鉴定氨基转移作用的简便方法及其原理； （2）进一步掌握纸层析的原理和操作技术； （3）了解氨基转移作用在中间代谢中的意义。

二、实验原理 氨基移换酶也称转氨酶,它能催化α-氨基酸的氨基与α-酮酸的α-酮基互

换，这种作用称为氨基移换作用。它在生物体内蛋白质的合成与分解等中间代谢中，在糖、脂肪、蛋白质三类物质代谢的相互联系、相互转化上，都起着很重要的作用。任何一种氨基酸进行转氨作用时，都由其专一的转氨酶催化。它们的最适pH接近7.4。在各种转氨酶中，以谷氨酸—草酰乙酸转氨酶（简称谷草转氨酶、GOT）及谷氨酸—丙酮酸转氨酶（简称谷丙转氨酶、GPT）活力最强。

三、试剂与器材 解剖器具、离心机、恒温水浴、干燥箱、台秤、层析系统等。

1/15mol/L磷酸缓冲液（pH=7.4）、1%谷氨酸溶液（用KOH中和至中性）、1%丙酮酸溶液（用KOH中和至中性）、0.1%碳酸氢钾溶液、0.05%碘乙酸溶液、15%三氯醋酸溶液、标准丙氨酸溶液(0.1%)、标准谷氨酸溶液(0.1%)、0.1%水合茚三酮乙醇溶液、酚溶剂。

四、操作方法 将兔击晕，迅速解剖，取出肝脏，在低温条件下剪碎。称取匀浆后，离心取

上清液，即为制备的酶液。体外氨基移换反应纸上层析法检查每人4个点（标准丙氨酸溶液、标准谷氨酸溶液、对照上清液、样品上清液）。点样放入层析罩内。用被酚所饱和的水溶液，平衡后，用带小漏斗的玻璃管从层析罩上加饱合酚试剂25ml于层析缸内。然后，立即盖紧塞子，当溶剂前沿达到距滤纸上端约2.5cm处，取出滤纸，晾干或吹干，以除去酚溶剂，喷洒0.1%茚三酮乙醇溶液，放入烘箱中显色氨基酸与茚三酮反应，在滤纸上呈现紫红