各种实验操作

玻璃体中提取分离得到。近年来，发酵法生产HA在国外已成为工业生产的主要方法，它具有成本低、提取步骤简单和产量高等优点. 国内的研究主要集中于从牛眼、鸡冠和人脐带等生物组织中提取，用发酵法生产HA尚未见报道，主要问题是没有高产HA的菌种。

本设计要求学生对野生菌种进行诱变，以期获得高产HA的变异株，同时对其发酵的最优培养基配比进行了探索，这对发酵法制备HA的工业生产具有重要参考价值。 三、试剂与器材

根据具体实验确定 四、实验内容

1.选择实验题目、路线和方法；

2.提出所需试剂、生物材料、仪器和设备的清单： 3.配置试剂、处理生物材料、安装仪器； 4.完成实验、提交实验报告。 五、关键步骤及注意事项

1.注意设计实验的合理性，可能性； 2.注意选取的实验材料成本问题； 3.注意实验过程的安全。 六、思考题

在菌种诱变过程中需要注意哪些问题

实验题目：富硒米曲霉菌种的筛选 实验类型：设计 学 时：10 一、实验目的

通过利用已学过的理论、方法(含查资料获得的新知识)自己独立设计并完成实验的全过程、分析实验结果，培养学生灵活运用知识的能力、实际动手能力、创造能力，实现向独立完成科研题目的过度。 二、实验原理

对出发菌株进行纯化筛选，进而诱变，从而筛选富硒米曲霉。 三、试剂与器材

根据具体实验确定 四、实验内容

1.选择实验题目、路线和方法；

2.提出所需试剂、生物材料、仪器和设备的清单： 3.配置试剂、处理生物材料、安装仪器； 4.完成实验、提交实验报告。 五、关键步骤及注意事项

1.注意设计实验的合理性，可能性； 2.注意选取的实验材料成本问题； 3.注意实验过程的安全。 六、思考题

在设计实验的过程中你学到了些什么？

实验题目：大豆蛋白的提取、含量测定、活性成分分析及氨基酸组成测定

实验类型：综合 学 时： 26 一、实验目的 （1）掌握蛋白质的分级提取和制备丙酮干粉的技术；

（2）学习Folin-酚法测定蛋白质浓度的原理和方法； （3）掌握标准曲线的制作方法和注意事项；

（4）掌握分光光度计的原理、使用方法和注意事项； （5）学习微量凯氏定氮法的原理和操作技术；

（6）通过双向纸层析，测定大豆蛋白的氨基酸组成，掌握分离层析的原理、

氨基酸纸上层析法的操作技术（包括点样、平衡、展层、显色、鉴定及定量）。

二、实验原理 大豆中含有丰富的蛋白质、根据其性质不同，可以分为水溶蛋白、盐溶蛋

白、醇溶蛋白、碱溶蛋白。将豆粉依次用上述溶剂提取，并用有机溶剂沉淀，可制得各部分蛋白质的干粉。

三、试剂与器材 分析天平、分光光度计、离心机、恒温水浴、真空干燥器、 凯氏烧瓶、

改良式凯氏蒸馏仪、锥形瓶、微量滴定管、水解管、鼓风恒温箱、水浴锅、吹风机、玻璃喷雾器、层析缸等。

四、操作方法

① 对大豆粉进行水、碱两步提取；

② 制作Folin-酚法测定蛋白浓度的标准曲线； ③ 测定两步提取液的蛋白浓度（Folin-酚法）； ④ 将提取的大豆蛋白制成丙酮干粉；

⑤ 用微量凯氏定氮法测定提取的大豆蛋白质含量： 样品→消化→蒸馏→滴定→计算

⑥ 双向纸层析测定大豆蛋白的氨基酸组成：

样品处理（水解）→点样→酸性层析液中展层→碱性层析液中展层→显色→ 定性鉴定。

五、关键步骤与注意事项

① 提取蛋白等电点沉淀时pH值的调节。 ② Folin甲、乙试剂的使用条件和干扰因素；

③ 小心加样，切勿使样品沾污凯氏烧瓶口部、颈部。 ④ 消化时，需斜放凯氏烧瓶（45o），火力先小后大，避免黑色消化物溅到瓶口、瓶颈壁上，以致影响测定结果。

⑤ 蒸馏时，切忌火力不稳，否则将发生倒吸现象。 ⑥ 样品水解温度保持105℃，使样品水解完全。

⑦ 层析液中的酸或碱的含量必须足够，而且在展层前必须用酸性层析液和氨水分别进行饱和，以防止层析滤纸上酸碱度不足的现象。

六、思考题

1、采用Folin的酚法测定样品的蛋白质含量时，样品中的什么物质对测定结果有干扰？ 2、作为标准蛋白的牛血清白蛋白在应用时有何要求。

实验题目：蛋白质的N-末端氨基酸测定

实验类型：基础 学 时： 10 一、实验目的 掌握FDNB法测定蛋白质N-末端氨基酸的原理和方法。

二、实验原理 FDNB与蛋白质在室温，pH=8.0—9.0条件下反应，生成DNP—蛋白；随之，

在105℃，6mol/LHCl条件下水解，生成DNP—氨基酸及其它游离氨基酸。由于DNP—氨基酸溶于乙醚，而其余氨基酸不溶，故用乙醚抽提出DNP—氨基酸，再将未知样的DNP—氨基酸与已知标准DNP—氨基酸共同进行纸层析，根据Rf值即可推断未知样N末端为何种氨基酸。

三、试剂与器材 锥形瓶，25—50ml分液漏斗，层析缸，离心机，黑纸，水解管，层析纸，

毛细管，离心管，培养皿 (1)10%碳酸氢钠溶液（2）1mol/L氢氧化钠溶液（3）5yNB乙醇溶液 （4）浓盐酸（优级纯）（5）乙醚的处理： （6）乙醇（7）1.6mol/L， pH=6.0的磷酸盐缓冲液。（8）6 mol/L 盐酸

四、操作方法 DNP—蛋白的制备、DNP—蛋白水解、DNP—氨基酸的抽提、DNP—氨基酸的鉴

定、计算迁移率Rf值

五、关键步骤与注意事项

1、由于反应期间有二氧化碳和氟化氢气体生成，因此，在振摇期间应间隔放气，以免反应液随气体冲出，腐蚀皮肤，且放气时管口不要对着别人。 2、反应过程中应注意溶液pH值的变化，使其保持在pH8.0-9.0，若低于此范围，应用1mol/L氢氧化钠溶液调整，注意pH值不可过高，若pH超过9，则易使FDNB分解成二硝基苯酚（DNP—OH）。

3、由于加入盐酸后，会有大量的二氧化碳气体产生，因此在加完每一滴盐酸，待反应产生

的气体消除后，再加入第二滴，防止气泡冲出管外。

4、以下步骤，均取血红蛋白单独操作。※ 每次洗涤液不必太多，以免离心时冲出，只需将

沉淀浸没即可。

5、最后一次醚洗涤后，弃去上清，不断搅拌沉淀直至黄色干粉状（此时可打开管上的胶布

和黑纸）。此步一定要不断搅拌，使乙醚很快蒸发，否则DNP—蛋白会结成硬块，不易水解完全。

6、水解管封管时，应先将管内的冷空气赶尽，否则在烘箱内加热时会膨胀引起管炸裂。 7、水解时间的长短与蛋白质及其N—末端氨基酸的种类不同而异。

8、水的用量不宜过多，以免DNP—丝氨酸或DNP—苏氨酸部分溶于水层，造成损失，醚层中含有醚溶性DNP—氨基酸。

9、DNP—组基酸和DNP—精基酸是水溶性的，不能被乙醚抽提，而留在水相。若怀疑蛋白

或肽的N—末端氨基酸是组氨酸或精氨酸时，则应将水层在60℃水浴上蒸干，再加入1ml蒸馏水，蒸干，反复两次以除去盐酸，再进行鉴定。

10、点样时不能太靠纸的边缘，以免溶剂效应，使点扩散，样品相隔也不要太近，以免互相重叠，丙酮加入量不要太多，以免浓度太低，走出的斑点颜色淡，但浓度过大，则易形成拖尾。 六、思考题

1、分析和鉴定 DNP—氨基酸采用什么方法？为什么采用此方法？ 2、盐酸、乙醚、乙醇及水洗的作用是什么？

实验题目：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量

实验类型：基础 学 时：10 一、实验目的 学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理。

掌握垂直板电泳的操作方法。

运用SDS-PAGE测定蛋白质分子量及染色鉴定。

二、实验原理 聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳法测定蛋白质的相对分子量（有浓缩样品特点，

可分次加样；不需解离亚基，适宜测定球蛋白，而对纤维蛋白有误差。电泳需2000伏特小时）

凝胶层析法测定蛋白质相对分子量（特点方法简单，样品用量少，而且有时不需纯物质，一般不引起生物活性物质的变化。局限性是pH6-8的范围内，线性关系比较好，但在极端pH时，蛋白质有可能因变性而偏离。

三、试剂与器材 低分子量标准蛋白试剂盒、30%丙烯酰胺（Acr）、10%过硫酸铵

10%SDS（十二烷基磺酸钠）、、 1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl缓冲液1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液、

0.05mol/LpH8.0Tris-HCl缓冲液 、TEMED（四甲基乙二胺） 样品溶解液、固定液、染色液、脱色液、电极缓冲液

垂直板电泳装置、直流稳压电源、移液管、滤纸、微量注射器、大培养皿 四、操作方法

1.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干, 准备2个干净的锥形瓶. 2.把玻璃板在灌胶支架上固定好.

3.按比例配好分离胶,用移液管快速加入,大约5厘米左右,之后加少许蒸馏水,静置40分钟. 注胶过程最好一次性完成,避免产生气泡.4.倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干,按比例配好浓缩胶,连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm处,迅速插入样梳,静置40分钟. 5.拔出样梳后,在上槽内加入缓冲液,没过锯齿时可拆去底端的琼脂糖. 6、加样三个。 （1）取10μl标准蛋白溶解液于EP管内，再加入10μl 2倍样品缓冲液，上样量为20μl。

（2）取10μl样品1溶液，再加入10μl 2倍样品缓冲液，上样量分别为5μl和10μl。

7.用微量注射器距槽底三分之一处进样,加样前,样品在沸水中加热3分钟，去掉亚稳态聚合。

8.电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电流恒定在10mA，当进入分离胶后改为20mA，溴酚蓝距凝胶边缘约5mm时，停止电泳。

9.凝胶板剥离与染色：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内，加入染色液，染色1小时左右。

10.脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰。 绘制标准曲线

以每个蛋白标准的分子量对数对它的相对迁移率作图得标准曲线，量出未知蛋白的迁移率即可测出其分于量，这样的标难曲线只对同一块凝胶上的样品的分子量测定才具有可靠性。

五、关键步骤与注意事项

1、固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹坏玻璃板.

2、凝胶配制过程要迅速, 催化剂TEMED要在注胶前再加入,否则凝结无法注胶. 3、水封的目的是为了使分离胶上延平直，并排除气泡 4、凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面. 5、样梳需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平. 6、要使锯齿孔内的气泡全部排出,否则会影响加样效果.

7、注射器不可过低,以防刺破胶体,也不可过高,在样下沉时会发生扩散. 8、为避免边缘效应,最好选用中部的孔注样. 9、剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分。 六、思考题

1、在不连续体系SDS-PAGE中,当分离胶加完后,需在其上加一层水,为什么? 2、电极缓冲液中甘氨酸的作用?

3、在不连续体系SDS-PAGE中,分离胶与浓缩胶中均含有TEMED和AP,试述其作用? 4、样品液为何在加样前需在沸水中加热几分钟?

实验题目：蔗糖酶的分离提纯及米氏常数的测定

实验类型：综合 学 时：26 一、实验目的（1）了解酶分离提纯的一般原理和步骤 （2）掌握有机溶剂分级和透析技术 （3）掌握柱层析的原理和方法

（4）学会3，5—二硝基水杨酸比色定糖法的原理和操作方法

（5）了解底物浓度和酶反应速度之间的关系 （6）掌握测定米氏常数的原理和方法

二、实验原理 l、细胞破壁：就酶在生物体内的分布，可分为胞内酶和胞外酶，蔗糖酶系

胞内酶。提取胞内酶时，要破碎组织和细胞，然后用一定的溶液提取，得到的材料称为无细胞抽提液。材料不同，破壁的方法也不同。我们用的菌体（微