2013《细胞培养》实验讲义

-100℃时可迅速浸入液氮中。

注意：冻存液在使用前应在4℃冰箱放置，因为其中的DMSO在常温下对细胞有害。 四、实验结果与讨论：

检查细胞的冻存效果：复苏冻存的细胞、检查细胞有无污染及其活细胞数，以及贴壁细胞复苏培养时的贴壁情况。试分析冷冻效果好坏的原因。 去、思考题：

1、细胞冷冻的原理是什么？

2、在细胞冷冻时常用的保护剂是什么？它有何作用？使用浓度多少？

实验七 细胞的复苏技术 一、原 理：

细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的-5～0℃，细胞仍能生长，活力受损不大。

二、实验材料：温度计，40℃水浴，细胞冻存管，培养液（含10％牛血清），离心机 三、实验方法：

1、取出冻存管，立即放入37~40℃水浴中，快速摇晃直至完全融化（应在1min内完成）； 2、离心细胞（1000r/min，5min）后，弃上清。用适量培养液悬浮细胞，转入培养瓶中37℃培养。 注意：

1、应在1min内使冻存细胞完全融化； 2、复苏过程中应戴手套和护目镜。 四、实验结果与分析讨论 五、思考题：

1、 细胞复苏时为什么要进行快速解冻？ 2、 如何进行细胞复苏？有何注意事项？ 3、 如何进行细胞的运输？

实验八 阳离子脂质体介导真核细胞转染

一、实验目的和原理

阳离子脂质体分子通常由三个部分构成：头部的阳离子、尾部的疏水烃基以及中部的连接键。阳离子和疏水烃基分别为结合核酸和膜磷脂的结构，而中部的连接键则决定

了阳离子脂质体分子的稳定性。

阳离子脂质体转染法的基本原理是利用这种分子中带正电的阳离子基团与带负电的DNA、RNA和寡核苷酸等以静电力结合。同时分子中另一部分疏水烃基则与细胞膜的磷脂层相作用，使得吸附了核酸的阳离子脂质体分子透过细胞膜而进入胞浆，为下一步外源基因的真核表达提供条件。 二、实验用品

1、无菌水: 高温灭菌; 分装；

2、专用于脂质体转染的无血清培养基（如Life Technologies公司的opti-MEM）； 3、含血清的完全培养基（无抗生素）； 4、经纯化，不含内毒素的待转染外源性核酸（如质粒DNA，siRNA等）； 5、阳离子脂质体；

6、经灭菌的Eppendorf管和移液器枪头。

三、实验步骤

1、转染前一天，将所培养的细胞胰酶消化并计数，接种到培养板中，待其生长至70-95%； 2、在Eppendorf管中用opti-MEM等转染培养基稀释适量的质粒DNA或siRNA（以Lipofectamine2000为例，其参考用量见表1）；

3、在另一Eppendorf管中用opti-MEM稀释一定量的阳离子脂质体，并在室温下孵育一定时间（取决于阳离子脂质体类型，如Lipofectamin2000，需孵育5～30分钟，具体参考表1），使其形成DNA-脂质体复合物； 4、将稀释后的核酸与经孵育的阳离子脂质体混匀，室温孵育15～20分钟；

5、将旧的细胞培养液吸出，PBS清洗1～2遍，换一定体积的转染培养基（参考表1）； 6、加入DNA-脂质体复合物，与细胞培养体系混匀，常规培养条件下孵育5～8小时，有必要时可以过夜；

7、撤去含DNA-脂质体复合物的细胞培养体系，添加常规的含血清细胞培养基； 8、24～48小时后提取细胞总蛋白或对细胞进行免疫荧光染色观察外源基因的表达或siRNA对于基因表达抑制的效果。

表1. 阳离子脂质体转染法推荐的试剂用量

培养规格 96孔板 24孔板 12孔板 6孔板 60mm平板 10cm平板

表面积/cm2 0.3 2 4 10

DNA/?g 0.05-0.2 0.1-0.8 0.4-1.6 0.8-4.0

RNA/pmol

1-5 4-20 10-40 50-100

细胞培养基/?l 100 500 10

3

2×10

33

稀释培养基/?l 各25 各50 各100 各250

Lipofectamine 2000/?l 0.25-0.5 1-2 2-4 5-10 10-20 30-60

5×10 各500 20 1.0-8.0 100-400

1.5×104 各1.5×103 60 5.0-24.0 300-800

注：此表格中数据根据Lipofectamine2000商品说明书进行优化 四、注意事项

1、细胞转染实验成败的关键在于转染前细胞的活性。在转染前务必使细胞处于指数生长期。 2、在培养板上接种细胞时，务必使细胞分布均匀，且尽量减少相互粘连在一起的细胞团。 2、阳离子脂质体与核酸形成的复合物的稳定事件是有限的，必须在其稳定期之内对细胞进行转染。稳定时间长短视脂质体种类而定，由各试剂供应商提供具体数据。

3、阳离子脂质体对于细胞具有毒性作用，因此需要在转染后一定时间，待大部分脂质体-核酸复合物进入胞浆后，更换新鲜的细胞培养基以确保细胞的活性。

4、对于非稳定转染的细胞，所导入的外源核酸的作用只能维持一定的时间，故需要在转染 后一定时间之内对转染效果进行检测（通常为72小时以内）。 五、实验结果分析与讨论 六、思考题

1、脂质体介导外源性进入细胞的机制是什么？ 2、外源性基因为何能在真核细胞内表达?