食品酶学实验指导书

食品酶学实验指导书

陆剑锋、孙汉巨 2009年03月

实验一 果胶酶的特性及其应用

一、实验目的

1. 掌握果胶酶活性的检测方法； 2. 了解与掌握果胶酶的特性； 3. 了解果胶酶在果汁澄清中的作用； 二、实验原理

果胶质是指植物中呈胶状的聚合碳水化合物，是植物细胞间层和细胞壁的重要组分。果胶质由三种化学成分：α-l，4-聚-D-半乳糖醛酸、阿拉伯聚糖和β-1，4-D-半乳聚糖。果胶质按其分子中D-半乳糖醛酸上羧基酯化程度不同，可分为原果胶、果胶酸和果胶酯酸。果胶是多缩半乳糖醛酸甲酯，为白色或黄褐色的粉末，溶于20倍的水则成粘稠状液体，与三倍或三倍以上的砂糖混合，更易溶于水，对酸性溶液较对碱性溶液稳定，不溶于乙醇及其它有机溶剂。

果胶酶(EC.3.2.1.15)是分解植物主要成分果胶质的酶类，与纤维酶相似，是一群酶，至少有8种酶分别作用于果胶分子的不同位点，基本上分为解聚酶和果胶酯酶两大类。前者能催化果胶解聚，后者能催化果胶分子中的酯水解。果胶水解酶澄清果汁分两步完成。首先由果胶酯酶切断果胶的甲酯基，生成果胶酸和甲醇，紧接着液化型的果胶酸酶使果胶质低分子化，生成带羧基的产物。多数羧基会与金属离子或其他成分结合而凝聚。这是可能发生二次沉淀的原因。

果胶酶广泛地分布于高等植物(胡萝卜、番茄、草莓、香蕉、桔子等)和微生物中。果胶裂解酶的生产局限于霉菌。其高产菌株多为曲霉和青霉属。解聚酶来自于霉菌、细菌等微生物和胡萝卜等植物中。果胶酯酶除在水果和蔬菜中存在外，在细菌相霉菌亦有发现。能引起橙、梨、苹果和香蕉腐败的微生物基本上都能产果胶酶，因为这些水果中果胶含量高。有利于分解果胶的微生物的生长和发育。虽然有不少微生物都能产果胶酶，但在工业生产中常采用真菌，例如产酶活力高的曲霉、青霉、核盘霉等。

果胶酶主要应用于食品工业，特别是水果加工。由于果汁粘度高，致使过滤困难和产率低。果实经破碎后榨汁，果胶溶出在果汁内，造成果汁浑浊，在储存中又会发生沉淀。利用果胶酶分解果汁中的果胶，是果汁和果酒澄清的最好方法，已广泛应用于苹果汁、葡萄汁、草莓汁和柑桔汁等的生产。

果胶酶的加量按成品酶活力而定，一般为0.003％-0.1％，在pH值为3-5, 35～55℃条件下作用2-12h。用前以果汁或水将酶稀释10-20倍。果浆用酶和果汁用酶均不能与酶同时使用膨润土、多酚物质和SO2（浓度要小于500mg/L）。为了检查澄清效果，可将一份果汁与二份（95%乙醇99∶浓盐酸1）混合液混合均匀，15分钟后观察，果胶分解完全则无絮状物出现。贮存：本品最佳贮藏条件为4-10℃，一般为室温贮藏，避免阳光直射。 三、实验材料与仪器

橘子等，果胶酶，95%乙醇。

721分光光度计；恒温水浴；离心机；移液管0.5、5毫升；离心管；温度计；试管；试管架；玻璃烧杯；比色管。

四、操作步骤

（一）温度对果胶酶活力的影响

1．取9支比色管，分别放入约10毫升橘汁，再分别加入1%浓度的果胶酶（0、0.1、1）毫升，再补加蒸馏水至总体积22毫升。充分摇匀，置恒温水浴中于35、45、55℃温度下反应2 h。

2．反应结束后，将反应液放入离心管中进行离心分离（3000rpm，5min）。 3．取上清液用蒸馏水稀释5倍后于721分光光度计于600nm处测吸光值。

4．计算

果汁澄清度（%）=（OD对照-OD）÷OD对照×100 式中：

OD对照——对照的吸光值（用蒸馏水代替酶液，与反应液同样操作）； OD——酶反应液的吸光值。

5．根据在三个温度下果汁的澄清度的比较，取澄清度最高的温度为最适温度（见表1-1）。

表1-1 温度对果胶酶活力的影响 实验序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 55 45 35 温度（℃） 果汁澄清度（%） — — — 结 果

（二）pH值对果胶酶活力的影响

1．取9支比色管，分别放入约10毫升橘汁，再分别加入1%浓度的果胶酶（0、0.1、1）毫升，每3个比色管分别补加pH为3、4和5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液至总体积22毫升。充分摇匀，置恒温水浴中于45℃温度下反应2小时。

2．反应结束后，将反应液放入离心管中进行离心分离（3000rpm，5min）。 3．取上清液用蒸馏水稀释5倍后于721分光光度计于600nm处测吸光值。 4．计算

果汁澄清度（%）=（OD对照-OD）÷OD对照×100 式中：

OD对照——对照的吸光值（用蒸馏水代替酶液，与反应液同样操作）； OD——酶反应液的吸光值。

5．根据在三个pH下果汁的澄清度的比较，取澄清度最高的pH为最适pH（见表1-2）。 （三）加酶量对果汁澄清的影响

以横坐标为添加的酶量，纵坐标为澄清度，作坐标图。用上述方法测定时，果汁的澄清度与酶量之间的关系在澄清度80%以下时，基本上近似直线，澄清度在80%时，肉眼也能看到几乎是透明的，因此将此作为反应终点。把添加0.1毫升和1毫升分别的澄清度，在坐标图上连接起来。找出澄清度达到80%时的最少使用酶量作为所需酶量。

（四）果胶酶活力的确定

在（三）的条件下，能使1毫升果汁有80%澄清的酶活力定为1单位。

酶澄清果汁的活力（μ/ml）= d÷V×5

式中：

d——酶的稀释倍数； V——所需酶量（ml）。

（五）果汁中果胶的检验

分别取在不同条件下作用2小时的果汁2.5毫升置比色管中，加入95%乙醇至总体积10毫升，振荡。因果胶不溶于乙醇中，如有果胶存在，则有浑浊和沉淀生成，比较浑浊生成量，可知果汁经果胶酶澄清效果。

表1-2 pH值对果胶酶活力的影响 实验序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9

五、附录：

柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（0.1mol/L），3.0—6.2 0.1mol/L柠檬酸：含C6H8O7.H2O 21.01g/1000ml；

0.1mol/L柠檬酸三钠：含Na3C6H5O7.2H2O 29.40g/1000ml。

pH 3.0 3.2 3.4 3.6 3.8 4.0 4.2 4.4 4.6

0.1mol/L 柠檬酸 (xml) 82.0 77.5 73.0 68.5 63.5 59.0 54.0 49.5 44.5 0.1mol/L 柠檬酸三钠 (yml) 18.0 22.5 27.0 31.5 36.5 41.0 46.0 50.5 55.5 pH 4.8 5.0 5.2 5.4 5.6 5.8 6.0 6.2 0.1mol/L 柠檬酸 (xml) 40.0 35.0 30.5 25.5 21.0 16.0 11.5 8.0 0.1mol/L 柠檬酸三钠 (yml) 60.0 65.0 69.5 74.5 79.0 84.0 88.5 92.0 5 4 3 pH 果汁澄清度（%） — — — 结 果