双水相萃取技术的发展及应用

需进行特殊处理。例如可以采用高分配系数和高选择性的多级逆流分配操作。

(9) 分配过程因素较多, 可以采取多种手段来提高分配选择性或过程收率。

2双水相萃取技术的应用

双水相萃取技术越来越受到人们的青睐,广泛应用于生物、医学、环境科学等各大领域,近几年来,双水相萃取技术的应用更加频繁。

2.1生物工程

2.1.1萃取分离抗生素

朱自强等[12]用8%的PEG2000与20%的(NH4)2SO4组成的双水相体系直接萃取青霉素G发酵液, 分配系数高达58.39, 浓缩倍数为3.53, 回收率为93.67%, 青霉素G对糖的分离因子和对杂蛋白的分离因子分别为13.36和21.9。

Su[13]在室温以及pH=10的条件下, 利用16.1%的PEG和12%的硫酸盐, 0.5mol·L- 1高氯酸钠组成的双水相体系成功地从鸡蛋蛋清中分离出高纯度的溶解酵素。

2.1.2萃取分离酶

张兰威等[14]采用双水相萃取技术分离提取风干香肠中蛋白酶,确定双水相体系组成(质量分数)为PEG100020%和MgSO425%,在此体系中风干香肠的蛋白酶主要分布在上相,最高酶活为12.37U?μg-1,纯化倍数为4.61,回收率为85%。

苏玉春等[15]采用双水相萃取法从黑曲霉AS3.4309的发酵液中提取木聚糖酶,得到双水相体系的最佳组成:选用PEG4000,其质量分数为19%,磷酸氢二钾质量分数为10%。在此条件下,木聚糖酶的提取效果较好,分配系数和上相产率分别为6.23和88.67%。

王蕾等[16]确定双水相萃取体系为:PEG质量分数30%、NaH2PO4质量分数20%、pH值6,在此条件下Geotrichumsp?SYBCWU-3脂肪酶经硫酸铵沉淀和双水相萃取两步纯化的纯化倍数达到最大,较Geotr-ichumsp?SYBCWU-3脂肪酶粗酶纯化了22倍。Geotrichumsp?SYBCWU-3脂肪酶纯酶为低温碱性脂肪酶,最适反应温度为15℃,最适pH值为9.5,相对分子质量为3.58×104。

房耀维等[17]利用聚乙二醇/磷酸盐双水相体系从PseudoalteromonasarcticGS230发酵液中直接萃取分离低温α-淀粉酶。结果表明,在pH值5.0的15%PEG1000/15%磷酸盐双水相体系中,低温α-淀粉酶的纯化倍数及回收率分别为4.8和87%。

周念波等[18]采用PEG600/(NH4)2SO4双水相体系直接从Bacillussp.LS发酵液上清液中分离壳聚糖酶。得到室温下双水相萃取最佳条件为:PEG60020%、(NH4)2SO420%、NaCl0.1%、pH值6.0,在此条件下,壳聚糖酶分配系数达5.91,萃取率达88.7%。

舒国伟等[19]利用PEG4000/(NH4)2SO4双水相体系萃取纤维素酶。结果表明,双水相体系的组成(质量分数)为(NH4)2SO48%、PEG400026%、pH值4.8时,分配系数为5.21,萃取率为79.4%。

张娟等[20]研究了果胶酶的双水相萃取,结果发现,在双水相体系组成(质量分数)为PEG100027%、硫酸铵19%、氯化钠0.002%、pH值5.0时,果胶酶的萃取效率较好,分配系数最高达14.0。

陈利梅等[21]采用双水相体系对葡萄糖氧化酶进行萃取,结果发现,葡萄糖氧化酶在25%PEG4000和10%硫酸铵的双水相体系中可获得较高的萃取率,达

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81.11%,分配系数为0.134。

朱旭国等[22]利用亲水聚合物PEG6000在高离子强度下失水沉淀夹带酶蛋白的特点,结合PEG/(NH4)2SO4双水相萃取得到高浓度酶蛋白,再经SephadexG-75柱层析纯化得到高纯度酶样品。结果表明,饱和度60%的(NH4)2SO4溶液可使PEG6000夹带沉淀出总酶活力95%的氯过氧化物酶,酶在PEG/(NH4)2SO4双水相体系中上下相分配率达到0.228以下,回收率达到65.2%,纯度提高了7.4倍。

2.1.3分离蛋白质

刘杨等[23]以PEG/ 硫酸钠双水相体系, 经一次萃取从钝顶螺旋藻(Spirulina platensis) 细胞破碎液中富集分离藻蓝蛋白。结果表明, 萃取最适宜的条件为12%PEG 4000, 15%Na2SO4, 1%KCl,藻蓝蛋白收率为91.2% , 分配系数达到8.01, 分离因数达到6.33。对于螺旋藻藻蓝蛋白的富集分离,双水相萃取法与传统的盐析沉淀法相比, 具有节省操作时间、简化操作过程、降低能耗和成本以及易于工艺放大等优点。

Long等[24]描述了生物偶联技术对胶状金纳米粒子在聚乙二醇( PEG)/葡聚糖双水相系统(ATPS)中分离蛋白质的影响。山葵过氧化物酶(HRP)通过直接吸附结合胶状Au纳米粒子。虽然HRP很少存在于相中,但HRP/Au 纳米粒子结合分离到PEG相, 结合15nm胶状金的因子高达150∶1。其他蛋白质/金纳米粒子结合在右旋糖酐相中分离大于2000∶1, 而自由蛋白为5∶1。分离程度取决于聚合物浓度, 分子量,纳米粒子直径, 在某些情况下取决于纳米粒子在ATPS中的浓度。通过结合金纳米粒子大幅度提高蛋白质分离, 在既不改变蛋白质的化学性质或聚合物的亲和力配体,增加聚合物浓度, 也不增加盐类浓度的情况下, 很大程度上归因于偶联物表面积的增加。吸附胶体1908光谱实验室第27卷粒子从而提供一个有吸引力的路线, 以增加酶和其他蛋白质在ATPS中的分离。此外, 这些结果表明在净化生物分子/纳米粒子结合中ATPS分离作为一个强有力的手段, 正越来越多地应用于诊断和材料方面。

Silva等[25]研究了不同分子量的PEG和pH值在聚乙二醇(PEG)+磷酸钾+尿素+水双水相体系中的液-液平衡, 描述了实验技能和分析方法, 得出了25℃时PEG(1450, 3350, 10000)+磷酸钾(pH7和9)+尿素(质量分数为6%)+水的双水相体系的平衡数据。每个体系测得了4条连接线。研究了25℃时pH7和9, 尿素质量分数为3%和6%的体系中溶解酵素、过氧化氢酶、B-牛乳糖的分离现象。

2.1.4萃取其他生物活性物质

Luechau等[26]研究了聚乙二醇-磷酸盐双水相体系分离DNA(pDNA)，让一个高分子量(HMW)PEG1450和一个低分子量(LMW)的聚合物PEG300与磷酸氢二钾结合。实验结果表明质粒pTX0161在PEG-磷酸盐双水相具有不同的分配系数。在HMW PEG(PEG1450-磷酸盐体系) , pDNA 只分离到下相。在LMW PEG(PEG 300-磷酸盐体系) , pDNA根据双水相体系中的相组分、体系温度和溶菌液的浓度分离到不同相。在体积比大于1的体系中, pDNA主要分离到上相。体积比在0.5—1时, pDNA主要分离到界面。体系比小于0.5的体系, 大部分pDNA在下相。在4—25℃时, 分离到上相的量减少, 但是分离到界面的量稳步增多。在25℃时, 大于80%的pDNA分离到界面。随着温度上升至40℃, 分离到下相的量稳步增多, 分离到界面的量下降。在20℃时,pDNA分离到界面的量逐渐增多, 溶菌液浓度为60%W/W时, 达到80%的最高回收率。在25℃时,大于80%的pDNA从浓度大于35%W/W的溶菌液分离到界面。在30℃溶菌液浓度为0—20%时,pNDA由上相转到

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界面。

Tubio等[27]研究确定了从A-胰凝乳蛋白酶(ChTRP)中分离胰岛素(TRP)的最佳条件, 并将其应用到用聚乙二醇/ 柠檬酸钠(PEG/NaCit)双水相体系从牛胰腺中液-液萃取胰岛素。研究发现PEG的分子量、pH 和连接线长度影响TRP和ChTRP的分离。由分子量为3350的PEG和柠檬酸钠形成的双水相体系在pH为5.20表现为最好的分离。NaCl 的加入量达到7%(W/W)时上相/下相的体积比下降到0.1, 这导致胰腺TRP在上相的回收率达到60% , 是净化的3 倍。生物质量达到总体系的25%(W/W)不影响产量和净化参数。

Salabat等[28]研究了L-色氨酸、L-苯基丙氨酸、L-酪氨酸3种氨基酸298.15K时在聚乙二醇+盐+水双水相体系中的分离现象, 分相盐为硫酸镁、硫酸钠、硫酸铵, 并且还研究了连接线长度、盐、侧链结构对氨基酸分配系数的影响。结果表明, 增加氨基酸的疏水性和连接线的长度会使分配系数相应的增加。另外, 含有Na2SO4的体系比其他2种盐氨基酸的分配系数大。实验数据由改进后的Virial-type模型计算, 比较模型与实验数据得出具有很好的一致性。

2.2在发酵工程中的应用

由于发酵液中成分比较复杂，目标产物含量低，而传统的分离纯化方法步骤繁琐，导致产品回收率低，成本居高不下。目前国内外已经有利用双水相体系从发酵液萃取分离目标产物的报道和研究，并取得了一些成绩。

Pan等[29]利用PEG 1500/NaH2P04体系从Trichoderma koningii发酵液中分离纯化β-木糖普酶，该酶主要分配在下相，下相酶活回收率96.3%纯化倍数33。

Maria等[30]利用PEG 1000/NaH2P04体系从Fusarium solanipisi发酵液中分离纯化角质酶，该酶主要分配在上相，酶活回收率91%，纯化倍数4.1。

Mirjana[31]利用PEG4000/Dex体系从Polyporus squamosus发酵液中分离果胶酶，该酶主要分配在上相，酶活回收率80.2%，纯化倍数2.45。

Martinha[32]利用PEG8000/(NH4)2S04体系从Kluyveromyces marxianus发酵液中分离胞外多聚半乳糖醛酸酶，该酶主要分配在上相，酶活回收率91%，纯化倍数19。

冯著等[33]采用8%的PEG4000,13%的Na2S04和6%NaCl组成的双水相直接从重组巴氏毕赤酵母发酵上清液中分离人溶菌酶，双水相萃取率达到96.63%，纯化因子为6.5。

黄瑛等[34]采用10%的PEG2000, 15%的磷酸盐和1%的NaCl组成的双水相系统从洋葱假单细胞G-63发酵粗酶液中提取脂肪酶，当系统的pH为8.0时，分配系数4.36，纯化因子3.98，脂肪酶的回收率达到87.25%

2.3在药物方面的应用

薛珺等[35]采用PEG800与吐温80组合表面活性剂、硫酸钱、水形成双水相体系萃取芦丁，芦丁在该双水相体系的平均萃取率为95.0%。

谢涛等[36]利用PEG 4000/K2HP04组成的双水相体系从三七中萃取三七皂普，三七总皂普的分配系数为14.2,回收率为96%。

赵爱丽等[37]利用26%的PEG6000与18%的K2HP04组成的双水相体系分离纯化黄菩普，黄菩普的分配系数达到29. 8，收率达到98.6%。

石慧等[38]利用25%PEG400, 12.0%(NH4)2SO4和3%NaCl组成的双水相体系从加杨叶萃取液中萃取加杨叶总黄酮，萃取率达到95%以上。

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朱自强等[39]用8%的PEG2000与20%的(NH4)2SO4组成的双水相系统直接处理青霉素G发酵液，分配系数高达58. 39，浓缩倍数为3.53，回收率为93. 67%，青霉素G对糖的分离因子和对杂蛋白的分离因子分别为13. 36和21. 90。

2.4在金属分离中的应用

传统的金属离子溶剂萃取方法存在着溶剂污染环境、对人体有害、运行成本高、工艺复杂等缺点。近年来, 利用双水相技术萃取分离金属离子达到了较高的水平。

Bulgariu等[40]将Cd(Ⅱ)加入到碘化物在pH 2.05—7.12的PEG(1500)-(NH4)2SO4双水相体系中萃取到PEG 相。红外光谱显示随着(NH4)2SO4溶液的酸度增加PEG氧化醚的质子不增加, 但是PEG相中水的含量减少。金属萃取到PEG相中改变了水分子与聚合物链的结合; 吸光度随着pH值的改变而改变。显微镜方法表明通过具体的相互作用在PEG 相中萃取金属的固着点依赖于物质的种类。这也取决于聚合物链结构的变化。

Bulgariu等[41]还研究了将几个实验参数作为函数在PEG(1550)-(NH4)2SO4

双水相体系中萃取Zn(Ⅱ)。PEG-盐双水相体系由2个不混溶相组成, 聚合物相和盐相, 这可以用来做萃取实验。在没有恰当的萃取剂时, 体系由体积相等的质量分数40%的PEG 和质量分数为40%的(NH4)2SO4构成, Zn(Ⅱ)主要留在盐相。改变盐溶液的pH值, 萃取效率改变不大。增加Cl- , 观察到Zn(Ⅱ)的萃取效率提高。在有Cl- 时, Zn(Ⅱ)的萃取效率取决于盐溶液的酸度和加入体系中Cl- 的浓度。

Silva 等[42]在磷酸钾与高分子-聚氧化乙烯(1500g·mol-1) 和三嵌段共聚物PEO(聚氧化乙烯)-PPO(聚环氧丙烷)-PEO构成的双水相体系中研究[Fe(CN)5(NO)]2-和[Fe(CN)6]3- 阴离子的分离现象。实验使用了疏水性不同的两种共聚物, L35(50% 环氧乙烷, 1900g ·mol-1)和F68(80% 环氧乙烷, 8400g·mol-1) 。研究了温度、连接线长度、相的疏水性函数在每个双水相体系中[Fe(CN)5(NO)]2-和[Fe(CN)6]3-阴离子的分配系数。比较阴离子的分配系数的大小L35

2.5与其它技术结合应用

双水相萃取技术有其独有的优点,如能与其它技 术结合应用,萃取分离效果更佳。双水相萃取技术与超声波、微波、壳聚糖沉淀相结合应用的研究已经比较成熟,其中与超声波分离技术结合应用得最多,具体情况如下表1所示。

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