三聚氰胺的性质及检测方法

抽至近干后，用 6 mL5%氨化甲醇溶液洗脱，收集洗脱液。固相萃取过程流速不超过 1 mL/min，洗脱液于 50℃下用氮气吹干，残留物用 5mL 热重蒸水溶解并转移至容样杯中，加入 2.0×10-3mol/L K2Cr2O7溶液 3.00mL、(1+1) H2SO4 2.00mL 后，在表9.1 的消解程序下进行消解。

表9.1 微波消解程序 步骤 1 2 3 4

样品的测定：

压强（MPa） 0.3 0.6 1.0 1.2 时间（min） 3 3 3 10 功率（w） 400 600 800 600 上述消解液于 300℃下在温控消化炉上排酸 10min，冷却后定容于 50mL 容量瓶，取 5mL调至 pH2.50，并加入 1.0×10-3mol/L EDTA，定容于 100 mL 容量瓶，在与绘制标准曲线的相同条件下测定即可。 标准曲线的绘制：

在设定仪器工作条件下，取不同浓度的Cr3+标准溶液经浓度为0.01 mol/L ~1 mol/L的盐酸溶液调至pH2.50后，用pH2.50的盐酸溶液定容为50.00mL，混匀，与5×10-4mol/L的luminol溶液（pH11.70）及6.0×10-2mol/L过氧化氢溶液依次进机测定其发光值，根据相对化学发光值与标准溶液浓度绘制的标准曲线如图3.2，可知，Cr3+在一定的浓度范围（5.0×10-7mol/L～1.0×10-5mol/L）内与其相对化学发光强度有良好的线性关系。 11.6 化学发光反应条件的选择

5×10-4mol/L的luminol；

鲁米诺溶液的最佳pH为11.70；

Cr3+分析试液的最佳测定pH为2.50；

6.0×10-2mol/L 的过氧化氢溶液进行测定； 选用K2Cr2O7+ H2SO4体系进行样品的消解； 样品的最大消解压力为1.2 MPa； 样品的最大消解功率为800W； 样品的最长消解时间为10min；

K2Cr2O7溶液的浓度为2.0×10-3mol/L； 加入(1+1) H2SO4的体积为2.00mL。 11.7 回收率

加标回收率实验，样品测得的回收率在 99.5%～100.9%之间。

表9.2 回收率测定结果 样品编号 1 2 3 4 5 6 本底值 1.8×10-2 1.7×10-2 1.8×10-2 1.8×10-2 1.9×10-2 1.9×10-2 (μg/g m) 测定值 1.013 1.015 1.021 1.018 0.028 1.026 (μg/g m) 加标量 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 (μg/g m) 回收率% 99.5 99.8 100.3 100 100.9 100.7 12 固相萃取—流动注射化学发光法测定奶粉中的三聚氰胺

12.1 原理

三聚氰胺可显著抑制鲁米诺-高锰酸钾体系的化学发光强度，建立了流动注射-化学发光快速测定三聚氰胺的方法。用于奶粉中微量三聚氰胺的测定，具有简便、快速、灵敏、准确的显著优点，结果令人满意。 12.2 实验仪器

离子分析仪

流动注射化学发光分析仪 石英亚沸高纯水蒸馏器， 电热恒温鼓风干燥箱 低速台式离心机 氮吹仪。 12.3 实验试剂

三聚氰胺标准品 甲醇 乙腈 鲁米诺 高锰酸钾 三氯乙酸 氨水 碳酸钠 氢氧化钠 碳酸氢钠 盐酸 奶粉。

12.4 标准溶液的配制

0.1mol/L高锰酸钾溶液：

称取 1.5803g 高锰酸钾，定容于 100 mL 容量瓶中，用时稀释即可。

8.0×10-3mol/L 三聚氰胺标准储备液、5.0×10-2mol/L 鲁米诺储备液、1%三氯乙酸溶液、5%氨化甲醇溶液的配制同0.1mol/L高锰酸钾溶液。

所有玻璃器皿用5%的硝酸浸泡5h以上，用去离子水和石英亚沸重蒸水洗净后投入使用。

12.5 奶粉样品的前处理及测定 提取样品：

称取2 g（精确至0.0001 g）乳粉试样于50 mL具塞塑料离心管中，加入15 mL1%三氯乙酸溶液和 5 mL 乙腈，超声提取10 min后，以4000 r/min 离心10 min。上清液经 1%三氯乙酸溶液润湿的滤纸过滤后，用 1%三氯乙酸溶液定容至25.00 mL，移取 5.00 mL 滤液，加入5.00 mL 水混匀后做待净化液。

SPE 净化：

用3 mL甲醇、3 mL重蒸水水活化阳离子交换固相萃取柱，移取3.00mL待净化液至固相萃取柱中，用3 mL水和3 mL甲醇淋洗，弃去淋洗液并将小柱抽

至近干后，用6 mL5%氨化甲醇溶液洗脱，收集洗脱液。固相萃取过程流速不超过1 mL/min，洗脱液于 50℃下用氮气吹干，残留物用热重蒸水溶解，并调 pH 至 2.50，冷至室温后定容于50 mL容量瓶，此为样品待测液，供流动注射化学发光仪测定。

标准曲线的绘制：

在设定工作条件下，不同浓度的三聚氰胺标准溶液经浓度为0.01 mol/L ~1 mol/L 的盐酸溶液调至 pH2.50 后，用 pH2.50 的盐酸溶液定容为50.00mL，混匀，与 6×10-4mol/L 鲁米诺溶液（pH12.50）及 1×10-5mol/L 高锰酸钾溶液依次进机测定其发光值，根据相对化学发光值与标准溶液浓度绘制的标准曲线。

样品的测定：

市售奶粉样品经过提取、净化，用盐酸调节pH至2.50后，用pH2.50的盐酸溶液定容为50.00mL，混匀，在与绘制标准曲线的相同条件下测定即可。 实验方法：

按图 4.2 所示安装好管道，启动仪器，在设定的工作参数下预热和走基线，待基线稳定后，注入待测定溶液，进行化学发光强度测定，以相对峰高定量。

12.6 化学发光反应条件的选择

鲁米诺的pH值为12.50试液pH 2.50，高锰酸钾浓度2×10-5mol/L，鲁米诺浓度 6×10-4mol/L；

高锰酸钾溶液的浓度为 1×10-5mol/L； 三聚氰胺分析液的最佳 pH 值为2.50。 12.7 回收率

以市售奶粉品牌一为样品，进行加标回收率实验，结果如表10.1所示。由此可知，样品测得的回收率在 96.1%～102.2%之间。

表10.1 回收率测定结果

样品编号 1 2 3 4 5 6 本底值(μg/g m) 1.5×10-2 1.5×10-2 1.6×10-2 1.5×10-2 1.5×10-2 1.5×10-2 测定值(μg/g m) 1.028 1.006 1.009 1.001 0.977 1.037 加标量(μg/g m) 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 回收率% 101.3 99.1 99.3 98.6 96.1 102.2

13 三聚氰胺的ELISA检测

13.1 原理

戊二醛法将三聚氰胺(Melamine)与载体蛋白进行偶联制备免疫抗原Melamine-BSA及包被抗原Melamine-OVA。对人工合成抗原进行紫外扫描,其紫外扫描谱图与载体蛋白及三聚氰胺的图谱有明显的差异,初步显示载体蛋白与三聚氰胺偶联成功。进一步分析Melamine-BSA中Melamine与BSA的摩尔比,复 合物中三聚氰胺与BSA的摩尔比为8156B1。用免疫抗原Melamine-BSA腹腔免疫BALB/c小白鼠,获得抗三聚氰胺的多克隆抗体,间接非竞争ELISA分析所得抗血清的效价达10000以上。间接竞争ELISA显示所制备的抗血清能有效识别三聚氰胺,与氰脲酸、三聚氰酸酰胺、三聚氰酸二酰胺无交叉反应。利用自制抗体建立牛奶中三聚氰胺的间接竞争ELISA检测方法,对奶样作0.1Lg/mL, 1Lg/mL, 10Lg/mL, 100Lg/mL, 500Lg/mL和1000Lg/mL六个加标浓度的回收率在70.30% 113.59%。

13.2 材料仪器 材料与试剂：

40孔酶标板; 三聚氰胺标准品;

戊二醛(浓度为75% );

牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OV); 弗氏完全和非完全佐剂,; 卡介苗;

羊抗小鼠Ig。 主要仪器：

UV-265FW分光光度计

ZFQ-85A型酶联免疫检测仪。 实验动物：

BALB/c小白鼠,健康雄性, 4周龄, 20g左右。 13.3 试验方法

（1）抗原的合成： 50mg BSA溶于5mL PBS ( 0.01mol/L、pH714磷酸缓冲溶液生理盐水)中, 5mg三聚氰胺溶于10mL甲醇中。将5mL GA (浓度稀释到25% )溶液和三聚氰胺溶液同时缓慢边搅拌边滴加至BSA溶液中,室温搅拌反应24h, 4000r/min离心5min,上清以PBS于4℃透析3d,即得三聚氰胺-BSA复合物。 （2）抗原的紫外扫描分析：

将BSA、三聚氰胺以及它们的复合物适当稀释后, BSA和复合物物以PBS为空白、三聚氰胺以甲醇为空白,在190nm 500nm波长范围内扫描,分析扫描图谱。 （3）复合物中三聚氰胺与载体蛋白的摩尔比分析：

取一定量的复合物溶于PBS, 280nm处测吸光值,计算BSA的摩尔数;同时取定量的复合物溶于甲醇中, 205nm (三聚氰胺的特征吸收波长)处测吸光值,计算三聚氰胺的摩尔数,然后计算复合物中BSA与三聚氰胺的摩尔比。 （4）抗血清的制备

免疫方法: BALB/c小白鼠先饲养、观察一周,无异样,断尾采血,制备阴性血清,与抗原三聚氰胺-BSA进行琼脂双向扩散,未出现沉淀带。然后,腹腔注射卡介