实验四 聚丙烯酰胺凝胶电泳

实验四 聚丙烯酰胺凝胶电泳

实验目的

1.掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理及其应用范围； 2.熟悉聚丙烯酰胺凝胶电泳相关缓冲液的配制方法。

实验原理

1.聚丙烯酰胺凝胶简称为PAGE为网状结构，具有分子筛效应。它有两种形式：非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE）及十二烷基硫酸钠——聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）；

2.非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。而SDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。

3.SDS是一种阴离子去污剂，具有变性和助溶特性，可按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，并打断蛋白质的氢键和疏水键，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷， 使SDS蛋白质复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响；

4.SDS-PAGE可使蛋白质在Tris-甘氨酸(pH8.3)缓冲液中，通过电泳的方法分离不同分子量蛋白质或测定蛋白质分子量的实验技术。

实验步骤

（一）相关溶液的制备

1. 30%丙烯酰胺（Acr）：称Acr 29g，甲叉双丙烯酰胺（Bis）1g，加蒸馏水至100mL，过滤后置棕色瓶中，4℃贮存可用1-2月。

2. 10%SDS（十二烷基磺酸钠）：10g SDS 68℃助溶于纯水。

3. 1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl缓冲液：称取Tris18.2g，加入50mL水，用1mol/L盐酸调pH8.8， 最后用蒸馏水定容至100ml。

4. 1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液：称取Tris12.1g，加入50mL水，用1mol/L盐酸调pH6.8， 最后用蒸馏水定容至100mL 5. 10%过硫酸铵(AP) 6. TEMED（四甲基乙二胺）

7. 2×样品溶解液：1.0mol/L Tris-HCl(pH6.8) 1mL， SDS200mg，β-巯基乙醇0.5mL （临用前加入，也可以200mmol/L二硫苏糖醇代替），溴酚蓝3mg，甘油2mL， 最后定容至10mL。

8.考马斯亮蓝染色液：取50%甲醇溶液90mL，冰乙酸10mL混匀，溶解称取考马斯亮蓝R250 0. 25g（可适当减少），过滤后备用。 9.脱色液： 甲醇300mL ，冰乙酸100mL，蒸馏水定容至1L。

10. 5× Tris-甘氨酸电泳缓冲液(pH8.3)：称Tris15.1g，甘氨酸94g，加入50mL 10%SDS，加蒸馏水使其溶解后定容至1L。 （二）制胶过程

1. 配制分离胶溶液（以12% 5mL PAGE为例）凝胶配制过程要迅速, 催化剂TEMED要在注胶前再加入。注胶过程要一次性完成,避免产生气泡。

成分 TEMED 10%AP 10%SDS 1.5MTris-HCl(pH8.8) 30?r-Bis H2O

2. 配制浓缩胶溶液（以5% 3mL PAGE为例）浓缩胶，也成为积层胶，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低，导电性较低，由于导电性与电场强度成反比，在浓缩胶内便形成了较高的电压梯度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，导电性高，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白根据其分子大小进行分离

成分 TEMED 10%AP 加入量 3μL 30μL 加入量 2μL 50μL 50μL 1.3mL 2.0mL 1.6mL 10%SDS 1.0MTris-HCl(pH6.8) 30?r-Bis H2O 30μL 0.38mL 0.5mL 2.1mL （三）样品处理、电泳、染色及脱色

1.样品处理：在浓缩胶聚合时，将2×凝胶上样缓冲液与待电泳样品混合，煮沸3min，使蛋白变性。

2.电泳：待浓缩胶聚合完成后（约30min），拔下梳子，以蒸馏水充分冲洗加样孔，加入适量样品（约15μL），无样品泳道以1 ×凝胶上样缓冲液加入，将电泳装置与电源连接（注意红色正极加入下槽），先按照8V/cm 电压（10mA）使样品在浓缩胶中泳动，待溴酚蓝进入分离胶后，加大电压到15V/cm (20mA)，直至溴酚蓝进入分离胶底部（约4h），停止电泳。

3.染色：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内，加入考马斯亮蓝染色液染色1小时左右。

4.脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰。 （四）结果分析

相对迁移率= 蛋白样品距加样端迁移距离（cm） 溴酚蓝区带中 溴酚蓝区带中心距加样端距离（cm）样端距 以每个蛋白标准的分子量对数对它的相对迁移率作图得标准曲线，量出未知蛋白的迁移率即可测出其分于量。标难曲线只对同一块凝胶上的样品的分子量测定才具有可靠性。 （五）注意事项

1. Acr和Bis均为神经毒剂，对皮肤有刺激作用，操作时应戴手套和口罩。 2. 玻璃板表面应光滑洁净，否则在电泳时会造成凝胶板与玻璃板之间产生气泡。 3. 样品槽模板梳齿应平整光滑。

4. 灌凝胶时不能有气泡，以免影响电泳时电流的通过。 5. 切勿破坏加样凹槽底部的平整，以免电泳后区带扭曲。

6.电泳时应选用合适的电流、电压，过高或者过低都会影响电泳效果。

7. 稀释5×SDS/电泳缓冲液至1×浓度灌入电泳槽,需800mL。