流感诊断Microsoft-Word-文档-(3)

具有一定血凝滴度即可鉴定。如血凝阴性，可盲传2代，如仍为阴性则弃之。

A3.2 组织培养法：用0.2mL处理过的标本液接种于长成单层的原代人胚肾(或猴肾或地鼠肾)，或狗肾传代细胞(Madin Darby Canine Kidney，MDCK)，每份标本接种4管，置37℃吸附1～2h后弃标本液，再加入每毫升含2μg胰酶的199维持液1mL，于33℃培养7～10d，并逐日观察病变。从第三天开始每隔一天用0.4%鸡或豚鼠红细胞对培养管做红细胞吸附试验(试验前无菌法收获细胞培养上清液)，如阴性则用已收获的上清液盲目传代，如阳性则测定上清液的血凝滴度。如标本第1代红细胞吸附试验阴性，可用收获的全部上清液混合进行盲传2代，仍为阴性则弃之。 A4 新分离株的鉴定

新分离流感病毒可用血凝抑制、补体结合、中和以及血细胞吸附抑制等试验方法进行鉴定。最常用和最简单的方法是血凝抑制试验，必要时采用补体结合试验。

A4.1 血凝抑制试验：用当前流行的甲3、甲1及乙型流感病毒代表株的免疫血清与新分

离流感病毒做血凝抑制试验，观察新分离株能否被免疫血清所抑制。血凝抑制试验方法见附录B。

A4.2 红细胞吸附抑制试验：取红细胞吸附试验阳性的组织培养管和正常细胞对照管，用Hanks液洗细胞2次，加入经霍乱滤液(RDE)处理(1∶10)的免疫血清0.2mL，再加入Hanks0.6mL，室温作用30min后，再加入0.4%鸡(或豚鼠)红细胞0.2mL，置室温30min后于普通光学显微镜下观察有无血球吸附。如果血细胞吸附被所用免疫血清所抑制，表明所分离的病毒与所用免疫血清型别相一致或接近。

A4.3 补体结合试验：如果用已知的甲型(甲3、甲1)或乙型或丙型流感病毒免疫血清对新分离病毒的血凝均不能抑制，则应考虑可能为甲型流感病毒的新亚型，可用针对甲型、乙型流感病毒核蛋白的免疫血清作补体结合试验定型。

3 血清学诊断方法编辑本段

B1 血凝抑制试验方法 B1.1 原理

一些动物红细胞(如鸡、豚鼠等)以及人“O”

型血红细胞上有流感病毒受体，遇流感病毒可产生红细胞凝集现象，简称血凝。若将特异性抗体与流感病毒(血凝素)预先作用后再加入红细胞则不产生凝集，称为血凝抑制现象。用定量血凝素与不同稀释度血清抗体作用后，能完全抑制血凝的最高稀释度，即为血凝抑制抗体效价。 B1.2 主要材料

大孔塑料板，1mL吸管或1mL移液器。 B1.3 双份血清收集及处理

急性期血清于发病3d内采取，恢复期血清于发病后2～4周采取。取0.1mL已分离的血清加入0.9(或0.4)mL霍乱滤液(RDE)(即1∶10或1∶5稀释)摇匀，于37℃水浴中过夜，以去除血清中的非特异性抑制素，次日置56℃水浴50min以灭活多余的RDE。 B1.4 流感病毒血凝素制备

流感病毒接种鸡胚后48h收获的尿囊液，加入1/10000硫柳汞防腐。为了延迟尿盐沉淀可先用无菌生理盐水做等量稀释，置4℃备用。 B1.5 鸡红细胞悬液的制备

从静脉或心脏抽取正常健康鸡血，保存于阿氏(Alsevr's)液中，置4℃保存。用前以生理盐

水洗3次，末次经2000r/min离心10min，将红细胞用生理盐水配成1%浓度。 B1.6 血凝素滴定

将流感病毒血凝素在大孔塑料板内用生理盐水从1∶5开始做系列倍比稀释，每孔0.25mL再加入等量1%鸡红细胞，摇匀，置室温或4℃30～45min后观察结果，以出现十十血凝的血凝素最高稀释度为其血凝效价，即为1个血凝单位，实验时采用4个血凝素单位，例如血凝素效价为1∶320，为1个单位，4个单位即为1∶80稀释。正式实验前经校对取4个血凝单位用于实验。

B1.7 血凝抑制试验步骤

B1.7.1 将上述已处理的待检血清(1∶10或1∶5)再用生理盐水做系列倍比稀释，每孔加0.25mL。

B1.7.2 加入等量已配好的4个单位血凝素。

B1.7.3 每孔加入0.25mL 1%鸡红细胞，摇匀置室温或4℃30～45min。 B1.8 结果观察

观察结果时将血凝板倾斜数十秒钟，待阴性