固定化细胞技术综述

固定化细胞技术综述及其应用

张弘扬1401024103 高娟丽1401024122 天津农学院 农学与资源环境 生物技术（1）班

摘要固定化细胞是将动植物或微生物细胞固定于合适的不溶性载体上的一种

技术 ，它既可以提高生产效率和生产能力、延长生产周期，又易于细胞的分离和回收。在生物、医药、环境保护、食品工业等方面得到了广泛应用。本文主要介绍了固定化细胞技术的方法，载体的选择与应用，综述了固定化细胞技术在工业、环境中的应用，并对其发展前景进行展望。

关键词 细胞固定化 固定化方法 细胞固定载体 生物反应器 酒精发酵 环

境治理

固定化技术包括固定化酶技术与固定化细胞技术。固定化细胞技术起步较晚，在20世70年代后才从固定化酶技术发展而来，它是指通过物理或化学的方法将分散、游离的微生物细胞固定在某一限定空间区域内，以提高微生物细胞的浓度，使其保持较高的生物活性并反复利用的方法。相对于固定化酶技术，该方法不需把酶从细胞中提取出来，且无需纯化，酶活力损失小。目前，固定化细胞技术的应用范围涵盖生物学、生化工程、有机化学、合成化学、高分子化学、食品与发酵工业、环境净化、能源生产等多个领域，已经成为生物技术中十分活跃的跨学科研究领域。本文主要对该技术及其应用进行了简单介绍，并对其发展前景进行展望。

一、生物细胞固定化技术

1、细胞固定化的原理及方法

固定化技术是使生物催化剂更广泛、更有效应用的一种重要手段，任何一种限制生物催化剂自由流动的技术都可以用于制备固定化生物催化剂。由于细胞的种类多种多样，大小和特性各不相同，故此细胞固定化的方法有很多种。Karel等人将其归纳为表面吸附、多介质包埋、隔离和自凝集4大类；王建龙把目前常用的固定化方法分为吸附法、包埋法、胶联法和截留法；杨文英等介绍了吸附法、包埋法、共价结合法、胶联法、多孔物质包络法、超过滤法、多种固定化方法联用等7种常用方法；成庆利等按有无外加载体将细胞固定化方法分为有载体固定

化法和无载体固定化法2种；张磊等按照固定化载体与方式的不同将其分为吸附法、包埋法、共价结合法和胶联法。[1]

传统的细胞固定化方法有四大类：包埋法、吸附法、交联法、共价结合（偶联）法。

包埋法：利用物理方法将细胞包埋在多空载体内部而制成固定化细胞的方法称为包埋法。包埋法可分为凝胶包埋法和半透膜包埋法。凝胶包埋法是应用最广泛的细胞固定方法。包埋法反应条件温和，酶蛋白结构极少受改变，而且固定化时保护剂的存在不影响酶的包埋产率。此方法对大多数酶、粗酶制剂甚至完整的微生物细胞都是适用的。不过包埋法仅适用于小分子底物和产物的酶，而且由于底物和产物扩散受阻，酶的反应速率可能受到影响。

吸附法：利用各种吸附剂，将细胞吸附在其表面而使细胞固定的方法称为吸附法。用于细胞固定化的吸附剂主要有硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、多孔塑料、金属丝网、微载体、和中空纤维等。按吸附原理又可分为物理吸附和离子吸附两种。吸附法的优点是操作简便、价廉、条件温和，对细胞活性影响小，但缺点是细胞结合不牢且数目有限，条件变化时易脱落。

交联法：交联法又称无载固定化法，是一种不用载体的工艺，通过化学、物理手段使生物体细胞间彼此附着交联。化学交联法它一般是利用醛类、胺类等具有双功能或多功能基团的交联剂与生物体之间形成共价键相互联结形成不溶性的大分子而加以固定，所使用的交联剂主要有戊二醛、聚乙烯酞胺、表氯醇等等。物理交联法在是指在微生物培养过程中，适当改变细胞悬浮液的培养条件(如离子强度、温度、pH值等)，使微生物细胞之间发生直接作用而颗粒化或絮凝来实现固定化，即利用微生物自身的自絮凝能力形成颗粒的一种固定化技术。该法操作简便，但在较剧烈条件下进行，一般固定化细胞活性不高，因此该方法的推广应用受到了一定的限制。

共价结合（偶联）法。共价结合法是细胞表面上官能团和固相支持物表面的反应基团形成化学共价键连接，从而固定微生物。该方法固定化微生物稳定性好，不易脱落，但限制了微生物的活性，同时反应激烈，操作与控制复杂苛刻，并且成本较高。

尽管固定化方法多种多样，但没有一种理想的、普遍适用的方法。化学固定化法（包括化学交联法和共价结合法）涉及细胞的化学修饰，但化学试剂的毒性对细胞会有损害，因此，不适用于制备固定化活细胞。但由于细胞与细胞或细胞

与载体间的结合力强，所以操作稳定性高。交联法和聚电解质复合包埋法的突出优点是可以获得很高的细胞密度，但由于缺乏良好的机械强度而不能得到广泛应用。

2、固定化细胞的载体

载体材料的性质很大程度上决定了微生物的附着固定和生长代谢状态，微生物量的多少也与载体材料的结构有关。因此固定化细胞的载体是细胞固定化技术能否成功的关键因素。

2.1载体的一般要求

通常情况下，一个理想的优良载体应具有以下特性：固定化操作方便，成型快；载体表面应具有化学活性集团,可以直接或经过活化后与生物分子偶联；载体应具备一定的容量,可以偶联足够的生物分子；载体的作用仅是使生物分子固定化,对生物分子无毒害作用，反应温和；载体应具有良好的生物相容性,对反应物和生成物的扩散阻力小；耐微生物分解，使用时间长和重复使用次数多；载体原材料广泛而且成本低廉。实际上，很少有一种载体材料能满足上述所有条件。通常总是根据工作性质去选择较为合适的载体材料。 2.2载体材料的影响因素

一般情况下，固定化的速率受载体材料表面粗糙度和电荷的影响，载体材料的表面粗糙度越大，微生物的附着越稳定；同时载体材料表面的空隙能较好地保护微生物，免受水力负荷的损害。研究表明微生物表面一般带负电荷，使用表面带正电荷的材料作为固定化载体能中和微生物表面的负电荷，可加速固定化速度，在液相中更易于微生物向载体表面的传输。 2.3载体材料的分类

目前，固定化技术所使用的载体材料主要有：天然载体材料、合成高分子载体材料、人造无机载体材料、复合载体材料等[2]。

（1）天然载体材料

天然载体材料包括天然无机载体材料和天然有机载体材料两大类。其中，利用沙粒、沸石、硅藻土等制作为天然无机载体材料，此类载体在水中不易流化，表面积较小，吸附的微生物量少，因而一般作为辅助材料。天然有机载体材料主要利用琼脂、海藻酸盐等天然多糖类材料，这些材料均具有良好的生物相容性、反应温和性、无毒性，多在研究和应用中被选用，其中又以海藻酸钠应用最为广泛[3]。但天然有机载体的缺陷是其制作固定化小球其强度稳定性较低，传质能

力差，且易被微生物分解，故使用寿命较短，因此需及时更新制备，以补充降解所耗。

（2）合成高分子有机载体材料

在实验和研究中常采用的是聚乙烯醇（PVA）、聚乙二醇（PEG）、聚氨酯（PU）等作为原材料。此类载体材料对微生物无毒害作用，反应温和，可提高微生物的存活率，相比于天然的载体材料，此类载体材料更不易被微生物降解，使用寿命更长，因此人们选用合成的高分子载体较多。聚乙烯醇是一种人工合成的有机多聚体凝胶，作为包埋载体有机械强度高，化学性能稳定、对微生物无毒、抗微生物分解能力强、价格低廉和使用寿命长等优点[4]。（3）人工制造的无机载体材料

此类载体材料利用的是人为制造的微孔结构将微生物进行固定，由此提高了载体中的微生物浓度，从而达到更好的处理效果。常见的人造无机载体有活性炭、多孔陶瓷、微孔玻璃、泡沫金属等。这些材料对于微生物的毒性较低，机械稳定性较高，因此提高了微生物对于废水的耐受性，同时由于他们不会被微生物所降解，因此使用寿命一般比较长。

（4）复合载体材料

由于有机载体材料和无机载体材料各有有缺点，而两类材料在许多性能方面互补，因此，利用组成和结构可调控的有机聚合物对传统无机载体材料进行改性修饰，制备兼具二者优良特性的负荷载体用于微生物固定化研究，受到了众多学者的青睐。

3、固定化细胞的生物反应器

固定化细胞生物反应器的分类方法很多，但主要按催化物的分布形式，结合反应器的机械结构进行分类。根据生物催化物在反应器内的分布形式可将生物反应器分为生物团块反应器和生物膜反应器[5]。生物团块是指细胞被包埋或固定为絮凝物或颗粒，以及自身形成的菌丝球，采用的反应器包括机械搅拌式反应器、鼓泡塔反应器气升式反应器和环流反应器。生物膜是指微生物在支持物上形成的一层黏膜状物，采用的反应器有固定床（填充床）反应器、流化床反应器、生物转盘、渗滤器、膜反应器等。

以下是几种常见的固定化细胞生物反应器。

填充床反应器：在此反应器中，细胞固定于支持物表面或内部，支持物颗粒堆叠成床，培养基在床层间流动。填充床中单位体积细胞较多，由于混合效果不