甲醇降解微生物的筛选与培养 - 图文

生物工程专业毕业论文

Abstract

With the needs of the development of industry, methanol is widely used, making methanol pollution to the environment is more and more serious. In order to better treatment of methanol wastewater pollution, experiment, with methanol as sole carbon source by using the method of enrichment culture to a methanol degradation bacterium strain was isolated from soil, through the observation of its morphological characteristics identification of the strains of gram negative, rod shorter. Through further analysis of the effect of environmental factors on the growth, determines the optimum culture conditions for methanol degrading bacteria of pH 7.5, temperature 28 ℃, speed 160 r/min, methanol content is 1%, the incubation time is 5 d. Explore methanol degrading bacteria optimum growth conditions, can for the immobilized microorganism technology such as modern biotechnology methanol wastewater treatment to provide effective basis.

Key word: methanol degrading bacteria; Screening; Growth conditions

IV

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1引言

甲醇作为一类重要的有机化工原料，用途广泛，是制造各种药品、染料、农药、喷漆、炸药、香料的原料[1]，但同时甲醇也是一种重要的有机污染物，广泛存在于石油化工、有机合成、林业化工和塑料等生产废水中[2]，随着工业的迅猛发展，工厂所排放的废气、废水中的甲醇含量明显增多，在污染环境的同时也危害着人类的健康安全[3]。由于甲醇的生物可降解性很强，因此其生物处理方法有着较为广阔的应用前景，不仅能在治理污染的同时节约能源，还能在代谢后转化出抗菌素、氨基酸、蛋白质等有用代谢产物，产生多重效益[4,5]。

本实验从土壤中筛选出一株能利用甲醇为唯一碳源生长的菌株，为微生物降解甲醇提供了菌种来源。

1.1甲醇及甲醇降解微生物的简介

1.1.1甲醇的简介

甲醇（methanol）是一种无色透明易燃易挥发的极性液体，能与水、乙醇、乙醚、苯、酮类和大多数其他有机溶剂混溶。由于甲醇在人体新陈代谢中会氧化成比甲醇毒性更强的甲醛和甲酸（蚁酸），饮用含有甲醇的酒可引致失明、肝病、甚至死亡，因此甲醇对人体有强烈的毒性。

甲醇可从煤制取，特别是可利用劣质高硫煤和焦炉气回收制取。工业上几乎全部采用一氧化碳加压催化加氢的方法来合成甲醇，其工艺过程包括造气、合成净化、甲醇合成和粗甲醇精馏等工序。 1.1.2甲醇降解微生物的简介

能利用甲醇作为能源和碳源生长的微生物是一类在能量代谢中利用一碳化合物产生还原力的细菌，即甲基营养菌，属于革兰氏阴性菌。其所利用的含甲基（-CH3）的一碳化合物有：甲醇、甲烷、甲基胺（H3NH2）和甲酸等。

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根据甲基营养菌对一碳化合物的利用功能，又将其分为两个亚群：一是专性甲基营养菌，此类细菌均能利用甲烷进行生长，其他物质如二甲醚和甲醇仅起维持生长作用。二是兼性甲基营养菌，这类细菌可利用许多碳源（包括一碳甲基化合物）进行生长，其中大多数兼性甲基营养菌能够利用甲醇和甲基胺 [6]。

1.2甲醇降解微生物的研究进展

对甲醇的微生物降解研究开始于20世纪60年代，报道出的甲醇降解菌株主要有：甲基杆菌 (Methylobacterium sp. ) [7]，甲烷八叠球菌(Methanosarcinaceae sp. )

[8]

，栖热袍 Thermotoga sp. ) [9]，脱硫肠状菌 (Desulfotomaculum sp. ) [10]等。 20世纪80年代英国莱斯特大学研究出一种新的甲醇利用菌，经鉴定为嗜甲基

菌属，属革兰氏阴性菌[11]。

2001年中国科学院沈阳应用生态研究所与哈尔滨工业大学的几名研究者对氮肥厂活性污泥进行驯化筛选得到3株甲醇降解菌，经鉴定均为假单胞菌属细菌[12]。

2007年中国河北省农业大学及农科院的学者利用富集培养的方法从化工厂活性污泥中分离到一株甲醇降解菌CYW–32，经对其形态特征、生理生化及16S rDNA序列分析，将菌株鉴定为嗜有机甲基杆菌(Methylobacterium organophilium ) [13]。

2009年中国医学院的孔庆胜等从活性污泥中筛选到一株可利用甲醇为唯一碳源和能源生长的细菌SDM11，该菌革兰氏染色阴性，短杆状。结合其形态特征和生理生化特性，该菌被初步鉴定为甲基营养菌属[14]。

1.3甲醇降解微生物的筛选原理

自然界中存在着各种各样的微生物，尤其是土壤微生物种类齐全，是微生物的大本营，所以从自然界中分离筛选微生物菌种，是我们获得优良新菌种最基本、最主要的方法。从混杂群体中分离特定微生物的常用方法有：控制培养基的pH值、控制分离培养基的营养成分、控制培养温度、添加抑制剂、对样品进行特殊处理、控制空气条件等。常用的纯种分离方法有简单平板分离法、平板划线分离法、毛细管分离法、土布分离法、稀释分离法、显微操作单细胞分离法等[15]。

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本实验采用平板分离法对甲醇降解菌进行分离与纯化，其基本原理是选择适合于待分离微生物的最适培养基和培养条件，创造一个只利于目的菌生长而抑制其他微生物生长的环境，从而可选择性地分离目的菌[16]。

1.4甲醇及甲醇降解微生物的应用

1.4.1甲醇的应用

甲醇用途广泛，是基础的有机化工原料和优质燃料。主要应用于精细化工，塑料等领域，用来制造甲醛、醋酸、氯甲烷、甲氨、硫二甲酯等多种有机产品，也是农药、医药的重要原料之一。

目前，随着人均能源消耗量的持续增大以及直接甲醇燃料技术的飞速发展，微型直接甲醇燃料电池（μDMFC）由于其广泛的应用前景而成为研究的热点。直接甲醇燃料电池作为当今最具有发展前途的可替代能源之一，主要作为便携式电源或移动电源应用于微电子设备、微型医疗器械、微机电系统、个人通讯设备等[17]。 1.4.2甲醇降解微生物在处理甲醇废水中的应用

目前对于甲醇废水的处理主要有物理处理法、化学处理法、生物处理法。常见的含甲醇废水的物理处理法有吸附法、焚烧法、汽化法等。常见的含甲醇废水的化学处理法有化学氧化法、湿式氧化法和电解氧化法[18]。

生物修复是治理有机污染的一种切实有效的方法，具有费用节省、能够最大限度地降低污染物浓度、可在现场处理污染土壤或水体、环境负面影响小等多重优势，所以一般认为生物法是去除甲醇污水中有机污染物最经济最有效的方法。利用海藻酸钠等包埋材料包埋驯化后的活性污泥制成固定化小球颗粒对甲醇废水进行处理，是利用甲醇降解菌处理甲醇废水的常用技术。目前国内外对甲醇废水生物处理工艺主要有上流式厌氧污泥床工艺、固定化微生物技术、厌氧序批反应工艺等[19]。

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