6-周光燕-西南菌种站濒危菌种丁酸菌的拯救复活与分离鉴定，《四川食品与发酵》2008年4期

西南菌种站濒危菌种丁酸菌的拯救复活与分离鉴定*

周光燕，王柱，张晓娟，王菊英，艾丽华，宋萍**

（四川省食品发酵工业研究设计院西南菌种站，成都温江611130）

摘要：采用多种分离培养方法对西南菌种站数百支砂土管保藏50余年的濒危菌种丁酸菌进行活化与分离，复活菌株100余株。分批对菌株进行生理生化鉴定及产酸能力测定，目前试验已取得阶段性成果，成功拯救复活丁酸菌种30余株，全部菌株提供社会共享利用。本文首批从中选取9株进行详细介绍。 2008-05-27 关键词：濒危菌种；复活拯救；丁酸梭菌；分离；鉴定；培养基

Study on Isolation,Identification and Rescue Resurrection of

Endangered Clostridum butyricum by SICC

ZHOU Guang-yan, WANG Zhu，ZHANG Xiao-juan，WANG Ju-ying, AI Li-hua,SONG Ping**

(Sichuan Academy of Food and Fermentation Industries ,

Sichuan Center Of Industrial Culture Collection, Chengdu 611130)

Abstract: By anaerobic cultivation，Endangered Clostridum butyricum were isolated and selected from the hundreds sand tube preserved more than 50 years by SICC, 100 stranis were rescued. These stranis were identified by physiological and biochemical experiments by batch processing. So far, testing had achieved initial results , more than 30 trains were successful rescued. All strains had been provision shared use. The test detailed briefing 9 strains selecting from 100 strains.

Key words: Endangered strains; Rescue resurrection; Clostridum butyricum;Isolation; Identification; Medium

上世纪五十年代末期到六十年代中期，四川省食品发酵工业研究设计院在省

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资助项目：1. 国家微生物菌种资源平台项目（2005DKA21204-04）

2. 四川省自然科技资源平台建设2006年度项目

作者简介：周光燕（1978-），女，理学硕士，工程师，主要从事微生物菌种资源开发应用研究。

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通讯作者：宋萍（1958-），女，高级工程师，20多年从事微生物资源的应用研究与保藏管理，项目负责人。

网址：www.sc-sicc.org.cn；E-mail：xnjzz@yahoo.com.cn；电话：028－82761464，028-82767630

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科技厅和轻工厅的支持下，开展了一系列的丁酸菌的选育和开发应用研究，获得 各种产丁酸优良菌种，用砂土管保藏于西南菌种站，至今已有50余个年头。由于历史的原因，期间不曾进行过活化或提纯复壮，菌种活力严重衰退或死亡，濒临灭绝。2005年起，西南菌种站在平台项目的支持下，先后对这批濒危菌种丁酸菌开展了活化培养、分离、筛选、鉴定、评价等一系列的复活拯救工作，并取得阶段性成果。

丁酸梭菌（Clostridium butyrium）又名酪酸梭菌，主要存在于奶酪、天然酸奶、人与动物粪便、某些树叶、土壤等自然环境中，一般在10%-20%健康人群中能分离得到[1]。是一类革兰氏阳性严格厌氧芽孢梭菌，发酵主要产丁酸，丁酸可促进肠黏膜修复及其功能恢复，并且能抑制炎症细胞因子的形成，从而起抗炎症作用[2-3]。丁酸还具有抗肿瘤作用，可减少肠道上皮细胞分化和凋亡，从而抑制肿瘤生长，并且这种作用对肿瘤等转化细胞具有特异性[4，5]。在1933年，就有日本千叶医科大学宫入近治博士首先发现并报告，将丁酸梭状芽孢杆菌作为微生态制剂来研究，因此又名宫入菌。日本最初将其用作整肠剂，广泛用于肠道菌群失调，急慢性腹泻，肠易激综合症，抗生素相关性肠炎等疾病的治疗；现也将用于畜禽饲料添加剂代替抗生素，发挥防病促长的作用。丁酸梭菌形成内生芽孢，具有耐高温、耐酸、耐胆盐、耐部分抗生素等特性，作为饲料添加剂和兽药，与非芽胞类活菌制剂相比，具有更为广阔的应用前景[6，7，8]。 1 材料与方法 1.1实验材料

西南菌种站于五十年代砂土管保藏的丁酸菌种数百支。 1.2 培养基 1.2.1 活化培养基

葡萄糖 3%； 碳酸钙 3% ； 蛋白胨 1% ； 牛肉膏 0.6%； 硫酸铵 0.09%； 硫酸镁 0.03%； 氯化钠 0.05%； 硫酸亚铁 0.01%； pH 自然 琼脂 2%

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1.2.2 分离培养基

胰蛋白胨 2 %； 牛肉浸膏 1 %； 酵母膏 0.6%； 葡萄糖 0.4%； 磷酸氢二钾 0.2%； 磷酸二氢钾0.1%； 硫酸镁0.04%； 氯化钙 0.02%； 硫酸亚铁0.01%； 盐酸半胱氨酸.HCl 0.05%； CaCO3 1% ； 琼脂 1.8% pH 7.2-7.4 121℃ 20min灭菌 1.2.3 富集培养基

不加CaCO3 ，其它成分同分离培养基。 1.2.4 鉴定培养基

⑴ 种子培养基:成分同分离培养基

⑵ 产酸指示培养基：在种子培养基中加入3mL质量浓度为0.4g/dL的溴甲酚紫. ⑶ 明胶液化培养基:在种子培养基中加入1.2g/dL的明胶 ⑷ 无碳基础培养基:

酵母膏0.1%; (NH4)2SO4 0.2%; 磷酸氢二钾 0.2%； 氯化钙 0.02%； 磷酸二氢钾0.1%； 硫酸镁0.04%； 硫酸亚铁0.01%；

盐酸半胱氨酸.HCl 0.05%; 碳源另加0.5%; pH 7.2-7.4 1.2.5 发酵培养基 I、合成液体培养基

不加琼脂，其它成分同种子培养基 Ⅱ、母糟窖泥浸液培养基

葡萄糖 5% ； 蛋白胨 2% ；牛肉膏 1.5%； 窖泥浸液 30%； 母糟浸液30%；pH 6.5-7.0 Ⅲ、玉米糖化液培养基

7-8°Be玉米糖化液，冷至35-37℃时，加少量玉米渣，1kg/cm2灭菌 产酸指示培养基、明胶液化试验、淀粉水解试验、糖发酵培养基等参照《伯杰细菌鉴定手册》[7]和《常见细菌系统鉴定手册》[9]配制。 1.3 实验方法

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1.3.1 活化操作方法：

37℃，44h 取1 ml（50%） 37℃，46h 砂土管保藏菌种 活化液体培养基 活化液体培养基 （2ml） （4ml）

37℃，48h 打管 不生长 斜面好氧培养 活化斜面培养基

37℃，48h 37℃，48h 生长良好 斜面厌氧培养 1.3.1 分离培养方法：

1） 将活化后在厌氧环境下生长良好的菌种转接到富集液体培养基中，37℃厌氧富集培养48h。

2） 将上述培养液置80℃水浴10min，转入富集液体培养基，37℃厌氧富集培养48h。

3） 将分离培养基分别倒入盛有不同稀释浓度富集菌液的平皿中进行分离培养， 37℃厌氧培养48h。

4） 挑取有溶钙圈的单个菌落，通过革兰氏染色镜检。将培养特征、菌落形态和显微形态均符合丁酸梭菌培养特征的纯菌株保存，待做生理生化鉴定和产酸能力测定 [7]。

1.3.2 菌种属种的鉴定

按照《伯杰细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》对分离的纯菌株进行生理生化实验，通过革兰氏染色、明胶液化实验、蜜二糖、松三糖、淀粉水解等相关属的鉴定实验，以及菌株对碳源和氮源的利用实验，将菌株鉴定到属或种。 1.3.3 菌株产酸能力的测定

将菌株按10%接种量分别接种到Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三种培养液中，37℃厌氧发酵培养10天、15天，采用0.1N NaOH溶液滴定菌株在发酵过程中产生的有机酸（以乙

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