85 细菌内毒素检查法usp37

<85>细菌内毒素试验USP37

装置

将用于验证过程的所有玻璃器皿和热稳定性材料置于干热灭菌箱中以除去热原。最小灭菌时间和温度一般为30min,250°。若需使用塑料器皿，例如微孔板或自动加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素且对试验无干扰的器械。【注：在本章中， “管”的意思包括其他任何反应容器，如微量滴定管】 试剂及试液

阿米巴溶解产物（鲎试剂）——鲎试剂是一种由寄生于鲎（中国鲎或美洲鲎）中的阿米巴虫的溶解产物（白血细胞）获得的冻干产品。该试剂符合有关法规要求。【注：鲎试剂会对一些除内毒素外的β-葡葡聚糖起反应。可利用鲎试剂不与葡聚糖反应，通过移除阿米巴溶解产物中会与葡聚糖反应的G因子或抑制阿米巴溶解产物的G因子反应系统和用于存在葡聚糖的内毒素试验。】

细菌内毒素检查用水（BET）——用注射用水或其他不与鲎试剂反应的在灵敏限度内的水。

溶菌液供试液——在缓慢搅拌下，阿米巴溶解产物（鲎试剂）溶于BET检查用水或鲎试剂生产商建议的缓冲液中，根据生产需要贮存重组的鲎试剂，冷藏或冷冻。

溶液的制备：

标准内毒素储备液——标准内毒素储备液是根据包装上的说明书，制剂标签上标准内毒素储备液的储存和制备，用现行的WHO国际标准校准过的USP内毒素标准品制备的。内毒素用EU表示。【注：1EU=1IU】 内毒素标准液——将内毒素储备液混合均匀，再用细菌内毒素检查用水对其作适当的系列稀释。尽快使用稀释液，以避免因吸附而失去活性。 供试液——供试溶液是通过用细菌内毒素检查用水溶解、稀释药物制备。某些物质或制剂可能在其他水溶液中被更适当地溶解、稀释。如有必要，调节待测溶液的pH值，使鲎试剂和样品的混合物pH在由鲎试剂生产者定的pH范围内。通常使用于pH范围在6.0-8.0的产品。pH的调节可以用鲎试剂生产者推荐的酸、碱或适当的缓冲液。酸和碱可以在已去除内毒素的容器中用浓缩液或固体和细菌内毒素检查用水制备。缓冲剂必须进行验证无内毒素和干扰因子。

最大有效稀释液（MVD）测定

最大有效稀释液是指内毒素限度待测样品的允许的最大范围的稀释液。用下列公式测定MVD：

MVD = (内毒素限度 × 供试液浓度)/（λ）

内毒素限度——注射药品的内毒素限度取决于剂量，等于K/M2，其中K是每千克体重内毒素的阈值热剂量；M是每千克体重产品的最大推荐剂量。当进行间隔频繁注射和连续输液时，M是指每小时给药的最大总剂量。在药典中，注射药品的内毒素限度规定为EU/mL, EU/mg, EU/单位生物活性，等。 供试液浓溶液——

mg/mL内毒素规定为重量（EU/mg）的情况下；Units/mL内毒素规定为重量（EU/单位生物活性）的情况下；mL/mL内毒素规定为重量（EU/mL）的情况下。 λ 凝胶法（EU/mL）或者用于浊度法和显色法标准曲线的最低浓度的标示灵敏度。

凝胶法

凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或量化内毒素的方法。在标准条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度。为确保实验的精确和有效性，按下面的准备实验中描述做鲎试剂的标示灵敏度和干扰因子确认的实验。

准备实验

鲎试剂标示灵敏度的确认实验 使用前用至少4个鲎试剂确认标示灵敏度λ，单位为EU/mL。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度确认试验。至少用USP细菌内毒素RS和BET水制备4个不同浓度（相当于2λ，λ，0.5λ,0.25λ）标准液。

取装有等容量（如0.1ml）鲎试剂溶液的试管，加入0.1ml不同浓度的内毒素标准溶液混合。如果使用冻干鲎试剂单个测试量的小瓶或安瓿，可直接加入上述溶液。将反应混合液按照生产商说明培养一个恒定周期（通常为37±1℃下60±2分钟），避免震动。为测试凝胶的完整性，将试管从恒温器中依次取出，缓缓倒转180℃，若管内形成凝胶，并且倒置时，不从管壁滑脱者为阳性；未形成完整凝胶者为阴性。最低浓度标准溶液在所有平行试验中均显示阴性该试验才有效。

反应终点是指系列递减的使鲎试剂凝结的标准内毒素浓度最小浓度。通过四个平行试验反应终点浓度的对数平均值，再取平均值真数，计算反应终点的几何平均值，如下式：

终点浓度的几何平均值=antilog（∑?/f）

∑?为系列反应终点浓度对数的总和，f为重复试验试管数。反应终点浓度的几何平均值即为鲎试剂灵敏度的测定值（EU/ml）。当这个值在0.5λ~2λ之间，标示灵敏度确认，并可用于内毒素检查。

凝胶法干扰因子试验 按表1制备溶液A, B,C,D，在抑制/增强试验中使用的供试品溶液应为未检出内毒素且不超过最大有效稀释倍数（MVD）的溶液，按上述鲎试剂灵敏度复核试验步骤操作。B和C溶液反应终点浓度的几何平均值按鲎试剂灵敏度确认试验公式计算。

溶液

内毒素浓度/加入内毒素的溶液

未加入/供试品溶液

2λ/供试品溶液

2λ/细菌内毒素检查用水

未附加/细菌

稀释液

稀释倍数

内毒素的初始浓度 —— 2λ 1λ 0.5λ 0.25λ 2λ 1λ 0.5λ 0.25λ ——

平行试验次数 4 4 4 4 4 2 2 2 2 2

Aa Bb Cc Dd

——

供试品溶液

细菌内毒素检查用水 —— —— 1 2 4 8 1 2 4 8 ——

内毒素检查用水

a

溶液A：未检出内毒素试验的供试品 b

溶液B：供试品的干扰试验 c

溶液C：标示鲎试剂灵敏度的对照 d

溶液D：细菌内毒素检查用水的阴性对照

只有当溶液A和阴性对照溶液D的所有平行管都为阴性，并且系列溶液C的结果在鲎试剂灵敏度复核范围内时，试验才有效。

若B溶液的检测结果可以反应供试品存在条件下的鲎试剂的灵敏度，当其测定值在0.5λ-2.0λ时，则认为供试品溶液在该浓度下不干扰试验，否则须进行干扰试验。

若供试品溶液在小于MVD的稀释倍数下对试验有干扰，应将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释，再重复干扰试验。使用更大倍数的稀释的供试品进行试验可以排除干扰。

可采用适宜的处理方法(如过滤、中和、透析或加热处理等)排除干扰。排除干扰方法的建立要在不失去内毒素的基础上，通过以下试验确认，用加有标准内毒素的样品经选择的去除方法处理后，重复干扰试验。 限度试验

操作方法：按表2制备溶液A、B、C、D。按鲎试剂灵敏度确认试验项下进行检查。

表2. 凝胶限度试验溶液的制备 溶液* A B C D

内毒素浓度/被加入内毒素浓度 无加入/稀释的供试品溶液 2λ/稀释的供试品溶液 2λ//细菌内毒素检查用水 无加入/细菌内毒素检查用水

平行试验试管数 2 2 2 2

*使用稀释倍数不大于MVD并按凝胶法准备试验-凝胶法干扰因子试验项下的处理溶液A和阳性对照溶液B。阳性对照溶液B和C含标准内毒素制剂为相应标示鲎试剂灵敏度的两倍。

阴性对照溶液D为鲎试剂水。

说明——若阳性对照溶液B和C的平行管均呈阳性，阴性对照溶液D的平行管均呈阴性，试验有效。若溶液A 的两个平行管均为阴性，判定供试品符合规定；若溶液A 的两个平行管均为阳性，判定供试品不符合规定。

当溶液A的两个平行管中的一管为阳性，另一管为阴性时，需进行复试。若复试中溶液A的两个平行管均为阴性，判定供试品符合规定。若复试中溶液A有一管或两管都为阳性，则判定供试品不符合规定。若供试品溶液在小于MVD的稀释倍数下为阳性，则需将溶液进行不超过MVD的进一步稀释并进行复试。

定量试验

操作——本方法系通过确定反应终点浓度来量化供试品中内毒素的含量。按表3制备溶液A、B、C和D，按鲎试剂灵敏度确认试验项下操作。

表3 凝胶定量试验溶液的制备 溶液 内毒素浓度/被加稀释用液 稀释倍数 所含内毒素平行管数 入内毒素的溶液 的浓度 Aa 未加入/供试品溶液 细菌内毒素检1 —— 2 Bb Cc Dd a2 4 8 2λ/供试品溶液 —— 1 2λ/细菌内毒素检细菌内毒素检1 查用水 查用水 2 4 8 未附加/细菌内毒素—— —— 检查用水 查用水 2λ 2λ 1λ 0.5λ 0.25λ —— 2 2 2 2 2 2 2 2 2 溶液A：供试品的以不超过最大有限稀释倍数的稀释液，用于干扰试验。随后的供试液稀释不超过最大有限稀释倍数。用细菌内毒素检查用水做４管稀释，分别为１,１／２,１／４,１／８，相关的稀释度被用于干扰试验，其它适当的稀释度也可能被用到。 bcd溶液B：含2λ细菌内毒素的溶液Ａ（供试品阳性对照） 溶液C：两个系列共４支管稀释，含标准内毒素浓度为2λ，１λ，,０．５λ，０．２５λ． 溶液D：细菌内毒素检查用水（阴性对照）。 计算及判定——满足下列三个条件，则试验有效：（１）阴性对照Ｄ溶液的２支试管为阴性；（２）阳性对照溶液Ｂ的的２支试管为阳性；（３）溶液Ｃ的反应终点浓度的几何平均值在０．５λ到２λ范围内。 对Ａ溶液进行内毒素检测，得到各系列稀释溶液反应终点的稀释率，将反应终点的稀释率乘以λ既得Ａ溶液的反应终点浓度。平行管的反应终点浓度即为样品的反应终点浓度。若试验选用供试品的稀释液，则将计算结果乘以供试品的稀释倍数即得供试品的细菌内毒素浓度。在有效试验中，若供试液的每个稀释度均为阴性结果，内毒素含量记为小于λ的（若是被稀释的样品被检查，则记录内毒素含量小于λ乘以最低稀释度）。若供试液的所有稀释度均为阴性结果，内毒素含量记为等于或大于λ乘以最高稀释度（例如，初始浓度乘以表３中的８倍λ值）。 两次平行试验的细菌内毒素含量小于个论中的规定值，则可认为符合规定。