细胞工程复习题

第二章：

1.目前，常用的植物细胞培养基种类有哪些？各有什么特点？

1）MS培养基 特点是无机盐和离子浓度较高，是较稳定的平衡溶液。 2）B5培养基 其主要特点是含有较低的铵，这是因为铵对不少培养物的生长有抑制作用。 3）White培养基 其特点是无机盐数量较低，适于生根培养 4）N6培养基 其特点是成分较简单，KNO3和（NH4）2SO4含量高。

5）KM8P培养基 其特点是有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素，广泛用于原生质融合培养。

2.常用的灭菌方法有哪些，各有哪些优缺点？

1）湿热灭菌（高压蒸汽灭菌） 优点：高温高压蒸汽对生物材料有良好的穿透力，能造成蛋白质变性凝固而使微生物死亡，是一种最有效的灭菌方法。 缺点：如果是对培养基或液体溶液灭菌，灭菌时间与需要灭菌的培养基或液体溶液的体积密切相关，时间不足达不到灭菌效果，时间过长培养基内的化学物质遭到破坏，影响培养基成分。 2）过滤除菌 优点： 3）干热灭菌 缺点：干热灭菌存在能源消耗大、浪费时间、安全性差问题

4）紫外线灭菌 缺点：由于紫外线穿透物质的能力很弱，所以只适于空气中和物体表面的灭菌，而且要求距照射物质以不超过1.2m为宜。

5）熏蒸消毒 优点： 方法简便，只需要把消毒的空间关闭紧密即可。 6）药剂喷雾消毒

3.动物细胞培养常用的培养基组成成分有哪几类，在离体培养中的功能是什么？ 1）天然培养基 对促进细胞生长繁殖、粘附及中和物质的毒性有一定作用。 2）合成培养基 血清的加入对培养非常有效，但对培养产物的分离纯化和检测会造成不便。 3）无血清培养基 细胞外基质能帮助细胞附着和铁壁；低分子营养成分是细胞生长和代谢所需的；激素与生长因子促 进细胞生长繁殖；酶的抑制剂，保护细胞不受培养基内残留酶的损伤。

第三章 1.基本概念 细胞的全能性：是指细胞具有发育成完整个体的遗传潜能。也可以指个体某个器官或组织已经分化的细胞在适宜的条件下再生成完整个体的遗传潜能。 外植体：是指由活体植物体上提取下来的，接种在培养基上用来进行离体无菌培养的离体材料，可以是器官、组织、细胞和原生质体等。

愈伤组织：脱分化后的细胞经过细胞分裂，产生无组织结构、无明显极性的松散的细胞团，称之愈伤组织（callus)

极性：通常是指在器官、组织甚至细胞中，在不同的轴向上存在某种形态结构和生理生化上的梯度差异。 细胞分化：是指发育起始状态的合子沿个体发育方向不断分化出形态结构、生理功能不同的细胞、组织、器官而最终形成完整植株的过程。即由于细胞的分工而导致其结构和功能改变或发育方式改变的过程。在细胞水平上，细胞分化是指细胞在形态、结构和功能上发生改变的过程。

去分化：已有特定结构和功能的植物组织，在一定的条件下，其细胞被诱导改变原有的发育途径，逐步失去原有的分化状态，转变为具有分生能力的胚性细胞的过程叫脱分化或去分化（dedifferentiation)。

再分化：脱分化细胞失去了分化的特征，但在特定条件下，可再次开始新的分化发育进程，最终形成各种组织、器官或胚状体等，即再分化（rededifferentiation)

体细胞胚： (somatic embry)又称胚状体，是指离体培养条件下没有经过受精过程而形成的胚胎类似物。 人工种子：（artificial seeds）又称合成种子（synthetic seeds）或体细胞种子（somatic seeds）。就是将离体培养中产生的胚状体或芽包裹在含有养分和保护功能的人工胚乳和人工种皮中形成的类似种子的颗粒。

2.人工种子繁殖体如何处理？人工种子的制备要点有哪些？

答：繁殖体的处理：①体细胞胚形成后，需要在无激素培养基上经过一定阶段的后熟培养，然后进行脱水干燥，再将畸形胚选出后才能进行包埋。在脱水之前用ABA处理体细胞胚强迫其进入休眠，更有利于长期储存。②微型变态器官繁殖体不能过度脱水，但亦需要适当干燥，除去表面多余的水分，同时要进行表面消毒处理以防止包被后的感染。为了延长储存时间，需根据使用季节进行适当的休眠处理。③以微芽为繁殖体时，不能进行脱水处理，但必需筛选生长健壮、组织充实的芽进行包埋。

第四章

1.离体繁殖中常见得技术问题有哪些? 如何克服或防止其发生？ 污染问题和褐变、玻璃化

污染问题预防措施１）通风 ２）去湿３）光照４）防霉5）改进外植体消毒方法或使用抗生素 褐变防治措施1）选择合适的外植体：一般来说，最好选择生长处于旺盛的外植体。 2）合适的培养条件：无机盐成分、植物生长物质水平、适宜温度和光照、及时继代培养均可以减轻材料的褐变现象。 3）使用抗氧化剂：在培养基中，使用半胱氨酸、抗坏血酸等抗氧化剂能够较为有效地避免或减轻很多外植体的褐变现象。

（4）使用吸附剂：使用聚乙烯基吡咯烷酮 、0.1%-0.5％的活性炭对防止褐变也有较为明显的效果

玻璃化防治措施1）降低细胞分裂素的浓度，调节激素配合2）增加培养基中的溶质水平，以降低培养基的渗透势3）降低氨态氮，提高硝态氮的含量；4）增加容器的气体交换，降低容器内相对湿度5）降低培养温度，增加自然光照。6）在培养基中添加间苯三酚、根皮苷或生长抑制剂等物质。

2.脱除植物病毒病有哪些方法？其原理是什么？ 物理方法

（1）高温处理又称热疗法

原理:一些病毒对热不稳定,在高于常温的温度下(35-40 ℃)即钝化失活,繁殖力下降,失去侵染能力,而植物基本不受伤害.

(2)、低温处理又称冷冻疗法 原理：降低温度能使病毒活力下降。 化学处理

(1)病毒抗血清预处理 ： 用齿舌兰环斑病毒（ORV）的血清处理兰属离体分生组织，提高了再生株中无ORV的植株频率。

(2).RNA抑制剂处理： 烟草愈伤组织培养基中加入2-硫脲嘧啶，可除去组织中马铃薯Y病毒（PVY）。放线菌D和放线菌酮能抑制原生质体中病毒的复制。

（3）三氯唑核苷：病毒唑，化学名称1,2,4-3唑-3-酰胺-1-β-D-呋喃核苷，防治动物RNA

病毒和DNA病毒病的广谱性抗病毒制剂。

生物脱毒方法（原理：培养材料中通常不含病毒，可通过植物组织培养就行脱毒） （1）、茎尖分生组织培养 （2）、微体嫁接脱毒 （3）、愈伤组织培养脱毒 （4）、珠心胚培养脱毒 （5）、花药培养脱毒

3.无病毒植物的检测方法有哪些？ （1）直接检测法:直接观察 （2）电镜检测法 （3 ）指示植物法 （4）血清学检测法

（5）分子检测技术：PCR技术、探针杂交技术

第五章

1.无病毒植物的检测方法有哪些？ （1）直接检测法:直接观察 （2）电镜检测法 （3 ）指示植物法 （4）血清学检测法

（5）分子检测技术：PCR技术、探针杂交技术

第六章

1.原生质体的培养方法有哪些？各有何优缺点？

⑴液体浅层培养法： 优点原生质体在液体环境中有较强的吸收营养物质的能力，表现出较强的细胞分裂能力。操作简单，对原生质体的损伤小，且易于添加新鲜培养基和转移培养物。 缺点：

原生质体分布不均匀，常常发生原生质体之间的粘连现象而影响其进一步的生长和发育。此外，难以跟踪观察某一个细胞的发育情况。 ⑵双层培养法——液体-固体双层培养法： 优点：

固体培养基中的营养物质可以缓慢放到液体培养基中，如果在下层固体培养基中添加一定量的活性炭，则还可能吸附培养物产生的一些有害物质，促进原生质体的分裂和细胞团的形成。

缺点：

不易观察细胞的发育过程。 ⑶固体薄层培养法 优点：

使原生质体处于固定位置，避免了原生质体的漂浮游动，有利于对单个原生质体的细胞壁再生及细胞团形成的全过程进行定点观察。 缺点：

培养基温度对薄层质量和原生质体分布有一定影响；另外，固体中单细胞生活能力弱，通气状况不良，第一次细胞分裂时间会推迟2d左右。

第十二章

1.简述动物细胞培养的特点与营养需求

答：针对动物细胞培养的各种方法，相应的培养特点：

1）、 转瓶（管）培养系统 （特点）优点：结构简单，投资少，技术熟练，重复性好，放大只需要简单地增加转瓶（管）数量。

缺点：劳动强度大，占地空间大，单位体积提供细胞生长的表面积小，细胞生长密度低，培养时监测和控制环境条件受限制。 2）、反应器贴壁培养 细胞贴附于固定的表面生长，不因为搅拌而跟随培养基一起流动。（特点）优点：比较容易更换培养基，不需要特殊的分离和培养设备。缺点：扩大规模较难，不能直接监控细胞生长情况。

3）、悬浮培养法，主要用于非贴壁依赖型细胞的培养。如杂交瘤细胞、

淋巴细胞、和许多肿瘤细胞等。特点：用于实验室的普通悬浮反应器，是一种带有搅拌器的旋转瓶。

4）、固定化培养，固定化培养是将动物细胞与非水溶性载体结合起来，在生物反应器中进行大规模培养的方法。特点：具有细胞生长密度高，抗剪应力和抗污染能力强，细胞易与产物分开，利于产物分离和纯化。

针对与植物细胞培养的区别，动物细胞的培养有一下特点：

a.培养基不同：植物细胞（固体培养基），动物细胞（液体培养基）

b.培养基的成分不同：动物细胞培养必须利用动物血清，植物组织培养则不需要。

c.产物不同：植物组织培养最后一般得到新的植物个体，而动物细胞培养因为动物体细胞一般不能表达其全能性，因此得到的是同一种的细胞。 d.原理不同：植物组织培养的原理为植物细胞的全能性，动物细胞培养的原理为细胞的增殖。 营养需求：

①动物细胞培养液的成分：葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等。动物细胞培养成功的关键在于培养液中是否含有动物血清，因为由于动物细胞生活的内环境还有一些成分尚未研究清楚，所以需要加入动物血清以提供一个类似生物体内的环境，此外动物血清中也包含了一些动物的激素和酶，可以促进细胞的发育。 ②动物细胞培养液的特点：液体培养基、含动物血清。

③动物细胞培养的条件：无菌、无毒的环境；营养物质（合成培养基）；温度和pH（36.5±0.5℃，7.2~7.4）；气体环境（氧气和二氧化碳）等。

2.简述细胞冷冻的原理和方法。 答：主要冻存方法：超低温保存。

细胞冷冻技术的关键是尽可能地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成。快冻慢溶。

3.接触抑制与密度抑制有什么异同。

答：接触抑制:细胞从接种到长满容器表面后，由于细胞繁殖数量增多相互接触后，不再增加——接触抑制。 密度抑制: 细胞接触汇合成片后，只要营养充分，细胞仍能进行增殖分裂，但当细胞密度达到一定程度后，营养相对缺乏，代谢产物增多，发生密度抑制现象。

4.试举一例说明细胞建系的全过程（列出主要方法、步骤及所需的仪器设备）。