微生物实验手册 - 图文

革兰氏染

Procedures of Gram Staining

初染媒染1min 脱色30s 复染2min G- G+ 结晶紫

碘液 95%乙醇 复红/番三、实验材料：

1、菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、环境中分离得到的菌种； 2、试剂：草酸铵结晶紫、卢戈碘液、95%乙醇、番红染液；

3、仪器材料：显微镜、酒精灯、载玻片、接种环、擦镜纸、二甲苯、香柏油、生理盐水等。 附：实验相关试剂配制方法

1、结晶紫染色液(Huclker改订)

A液：结晶紫 2.5g，

95%酒精 25.0ml； B液：草酸铵 1.0g，

蒸馏水 100ml。 将结晶紫研细后，加入95%酒精，使之溶解，配成A液。将草酸铵溶于蒸馏水，配成B液。两液混合即成。

2、卢戈氏碘液的成份为5%碘、10%碘化钾的清水。 碘本身很难在水中溶解，但是假如水中已经有被溶解了的碘离子的话，那么碘可以通过形成多碘离子而被溶解；碘很容易溶解在乙醇中，但是由于乙醇易燃、易挥发、有时会导致副作用，因此有时乙醇不宜作为溶液。溶有碘的乙醇被称为碘酒。

试剂配方：

碘化钾 2g；

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蒸馏水 300ml；碘 1g。 先将碘化钾溶于少量蒸馏水中，待全溶解后再加碘，振荡溶解后稀释至300ml，保存在棕色玻璃瓶内。用时可将其稀释2-10倍，这样染色不致过深，效果更佳。

四、实验步骤

（1）涂片：常规方法涂片； （2）干燥：让涂片自然晾干；

（3）固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）；

（4）初染：加适量（以盖满细菌涂面）的结晶紫染色液染色40s；水洗至流出水无色，吸去残水；

（5）媒染：用碘液覆盖菌膜1min，水洗至流出水无色；

（6）脱色：将玻片上残留水用吸水纸吸去，在白色背景下将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇脱色（一般20-30s）至流出液无色，立即用水洗去乙醇；

（7）复染：将玻片上残留水用吸水纸吸去，滴加番红复染3min；水洗，吸去残水；

（8）晾干；

（9）镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。

五、注意事项:

1、革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响，难以严格规定；

2、染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果；

3、尽量选用幼龄的细菌。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。

六、实验结果

描述你所处理的至少4种菌的染色效果。

七、思考题

1、革兰氏染色是否成功，有哪些问题需要注意，为什么？ 2、为什么用老龄菌进行革兰氏染色会造成假阴性？

3、你认识革兰氏染色法中哪个步骤可以省略？在何种情况下可以省略？

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实验七 霉菌的形态观察及放线菌的制片

一、实验目的

1、观察霉菌的基本形态；

2、学习插片法、玻璃纸法制作放线菌观察玻片的方法。

二、实验原理

（一）放线菌制片

和细菌的单染色一样，放线菌也可用石炭酸复红或吕氏碱性美蓝等染料着色后，在显微镜下观察其形态。

放线菌基本结构主要包括气生菌丝、基内菌丝及孢子丝三类。通过设计各种培养和观察方法如插片法、搭片法、玻璃纸法、印片法等，可保持放线菌自然生长状态下的形态特征。

（二）霉菌制片及形态观察

霉菌菌丝较粗大，细胞易收缩变形，而且孢子很容易飞散，所以制标本时常用乳酸石炭酸棉蓝染色液。此染色液制成的霉菌标本片其特点是：(a)细胞不变形；(b)具有杀菌防腐作用，且不易干燥，能保持较长时间；(c)溶液本身呈蓝色，有一定染色效果。

霉菌自然生长状态下的形态，常用载玻片观察，此法是接种霉菌孢子于载玻片上的适宜培养基上，培养后用显微镜观察。此外，为了得到清晰、完整、保持自然状态的霉菌形态还可利用玻璃纸透析培养法进行观察。此法是利用玻璃纸的半透膜特性及透光性，将霉菌生长在覆盖于琼脂培养基表面的玻璃纸上，然后将长菌的玻璃纸剪取一小片，贴放在载玻片上用显微镜观察。

无隔膜菌丝 细胞形态 有隔膜菌丝

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匍匐菌丝、假根，功能是固着和吸收营养。

霉菌的无性繁殖方式主要是无性孢子，其类型有：

（1）厚垣孢子：厚垣孢子由部分菌丝内细胞质收缩变圆，外壁变厚而形成的孢子，圆形或者柱形。

（2）节孢子：由菌丝断裂而形成。菌丝生长到一定阶段时出现横隔膜，然后从隔膜处断裂，产生很多单个孢子。常成串、短柱状。

（3）分生孢子：霉菌发育到一定阶段，在分生孢子梗的顶端细胞分割缢缩而形成的单个或成簇生的孢子，形态多样。

（4）孢囊孢子：孢囊孢子为内生孢子。霉菌发育到一定阶段，气生菌丝顶端膨大，形成圆形、椭圆形或梨型的“囊状结构”。在囊的内部聚集大量细胞核并与其周围的细胞质浓缩形成孢囊孢子，如根霉和毛霉。

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