高产淀粉酶芽孢杆菌菌株的筛选

520啪的波长下比色测定吸光度值。并建立通过吸光度值 求麦芽糖含量的回归方程。 表1淀粉酶标准曲线的制作

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(2)粗酶液淀粉酶活力测定。①待测粗酶液的制备。将 活化的芽孢杆菌菌液接种于种子培养基m中，35℃，培养12 h，然后以5％的接种量接种于发酵培养基Ⅲ中摇床培养，160 r／rain，37℃培养48 h。发酵24 h后补加碳酸钙使整个发酵 过程中碳酸钙的含量保持在0．02％左右。离。b(4 000 r／rain， 20 min)，收集上清液即为待测粗酶液。②按以下顺序操作。 取20 Inl具塞刻度试管，预先洁净灭菌干燥，编号。取粗酶液 1 ml--)-2％的可溶性淀粉l IIll，蒸馏水3“，于60℃水浴中预 热5而fr一加浓度0．1 mol／L柠檬酸缓冲液(pH值6．0)1 nd，于 60℃水浴中保温30 min一加入1．5 IIll 3，孓二硝基水杨酸，沸

水中5 min，迅速冷却，加蒸馏水定容至20 n讧。③空白对照加 发酵液后加川值为3．6以下的酸钝化口．淀粉酶，使酶失活， 其余步骤同上。④定容后，摇匀，用分光光度计测定 0口锄。值。

在上述条件下以单位体积样品在30 rnin释放l mg麦芽 糖所需的酶量为一个麦芽糖单位表示酶活性。

1．2．2发酵条件的初步优化。从发酵培养基初始pH值、发

酵温度、发酵时间方面对上述筛选到的产酶活力最高菌株进 行优化，以提高目的菌的产酶活力。酶活测定方法同3。5．二 硝基水杨酸显色法。

圈1出现透明圈的芽孢杆菌菌落

f豫．1最粥i‰印p．∞b呵of q■暇而氅trmgOm虹d旧e 2结果与分析

2．1染色法初选结果革兰氏碘液染色法初选，有9株芽 孢杆菌菌落周围均具有透明圈(图1)，说明有分泌淀粉酶的 特性，分别测量9株芽孢杆菌的染色圈直径／菌落直径比值， 结果见表2。其中菌株编号为Pat03、Pab02的比值较大，分别 为2．284、1．961。虽然透明圈的大小直接反映了酶浓度的高 低，但不能完全代表菌株产酶能力，其原因是多方面的，固体 和液体培养基条件不同；不同菌株具有不同的生长和产酶速 度及不同的淀粉酶酶系；菌苔大小及在平板上堆积情况的差 异等都会造成透明圈大小不同，所以液体发酵复选必不 可少。

表2淀粉分解菌酶活力初选结果

'it02e 2 ‰p岫鳅阳啦re卿tts aboat棚帮雅aai,柳西棚吲l舯哪皤

Bacillus印p． 菌株

菌落直径∥一染色圈直径∥arI染色圈直径／菌落直径

．． Colony st{面iIlgcyde鼬mIlg cycIe di船 !ya'gara

查塑!!!要查型堕!型型鲤!尘堡!塑

Pab03 1．243±0．048 2．839±0．053 2．284 Pab02 1．40l±0．033 2．748±O．042 1．96l Pab01 1．∞l±0．028 2．054±0．015 1．710 nI如4 1．33l±0．017 2．101±0．048 1．579 PKC01 1．57l±0．019 2．364±0．046 1．505 朔孙1423 1．447±0．072 2．135士0．05l 1．475 PSAFl 1．651±0．015 2．175±0．052 1．317 瑚l(ol 1．004±0．046 1．245±0．026 1．240 PSA38 1．938±0．097 2．295±0．113 1．184 2．2 3。孓二硝基水杨酸显色法测酶活力结果将初筛有染 色圈的9株芽孢杆菌作发酵培养试验，经3，5．二硝基水杨酸 显色法对发酵培养粗酶液淀粉酶活力进行精确测定，结果表 明，菌株PSAFl、PKC0l、PJK0l、PahOl、Pah02、P曲∞、Pah04、 PI)M423、PSA38所对应的淀粉酶活力分别为(O．366±0．022)、 (4．27l±0．028)、(0．704±0．089)、(17．2回±2．731)、(21．52l±

1．390)、(31．331±0．985)、(4．744士0．嘟)、(1．920±0．043)、 (1．520±O．089)U。其中酶活力最高的为编号Pab0B、P蛆J02的

菌株，这与初选结果一致。菌株的酶活力与国内众多学者测 定的范围基本一致。不同芽孢杆菌菌株在不同发酵条件下 测定的纤维素酶活力之间存在着很大的差异，其原因是酶的 合成受很多因素的影响：首先酶合成受菌体生长速率影响较 大，其次酶合成还与诱导物的诱导作用及能量代谢有关。 3结论与讨论

国内学者对产生淀粉酶的芽孢杆菌的筛选、芽孢杆菌淀 粉酶的性质、基因序列分析等也作了大量的研究。张丽苹等 从土壤中筛选出一株能产2种小淀粉酶的脂肪芽孢杆菌，测 定其发酵液酶活为70 u／IIll?。卢涛等分离到一株产a．淀粉 酶的凝结芽孢杆菌，经过诱变筛选后发酵液酶活达100

U／玎lI№J。柏建玲等对益生素“益畜宝”的有效成分地衣芽孢 杆菌的产酶特性进行了初步定性研究，该芽孢杆菌具有很高 的淀粉酶活性一J。该试验对10株益生菌产淀粉酶的活力进 行了筛选，其中9株菌具有分泌淀粉酶的能力，编号为 Phb03、Pal]02的2株枯草芽孢杆菌产酶活性最高，在未作发酵 条件优化的前提下，酶活力分别达31．331、21．521 u，在作为 新型消化酶饲料添加剂方面具有广阔的应用前景。 (下转第5371页) 万方数据

3r7卷12期汪承刚等甘蓝亲本防退化技术研究5371 2．4生根培养效果将幼苗转入生根培养基上1周后即可