曹淑：“培养液中酵母菌种群数量的变化”实验研究(生物学教学)

“培养液中酵母菌种群数量的变化”实验研究 曹 淑 胡 薇 俞如旺*

（福建福州 福建师范大学生命科学学院 350108） 手机：15806023819 E-mail：shuxuefirst@163.com

摘 要 为探明适用于高中生物学教学拟合种群数量“S”型增长的实验变量数据，实验探究了接种量和溶氧量两个变量对酵母菌种群数量增长的影响，找出适于进行数学建模的实验变量组合，并针对实验中出现的问题提出几点改进方法和教学建议。

关键词 酵母菌 种群数量 实验改进

“培养液中酵母菌种群数量的变化”实验是高中生物教学中的一项重要探究活动。人教版教材建议探究不同影响因素对酵母菌种群数量增长的影响，实验具有一定的开放性。本文选定接种量和溶氧量两个因素作为自变量，探究酵母菌种群数量增长的模式，并提出一些实验改进和实施课堂教学的一些建议。 1 实验准备 1.1 菌种来源

本实验所用的菌种来源是福建师大微生物实验室冷藏在固体培养基上的贮用酵母菌，不含杂菌，采用液体接种方法将酵母菌接种于液体培养基进行扩大培养，12h后酵母菌种群数量进入对数期，供探究活动使用。 1.2 液体培养基配制

量取50 ml蒸馏水，称取5克酵母粉和2.5克葡萄糖一起加入250mL锥形瓶中，加热混匀，塞好瓶口。 1.3 灭菌

用高压蒸汽灭菌方法（121℃灭菌20min），发现培养基颜色由棕黄变为黑褐色。经试验，在此培养基上酵母菌基本不生长。原因分析：含葡萄糖培养基经高温灭菌，葡萄糖易被碳化，产生有害色素。

改进：采用115℃20min灭菌。一般来说，高压蒸汽灭菌有115℃20min、115℃30min、121℃15min、121℃20min等灭菌模式。分别用这四种灭菌方法对液体培养基灭菌，对比结果，115℃20min灭菌效果最好，培养基颜色没有发生明显变化。 2 探究活动 2.1 提出问题

不同版本教材中提出的问题示例大都为“培养液中酵母菌种群的数量是怎样随时间变化的”。实际上，酵母菌种群数量的增长与实验条件密切相关。教学中，教师可引导学生进一步探究影响酵母菌种群数量增长的不同因素，如温度、培养液成分和浓度、酵母菌菌种性质、接种量、溶氧量、pH值等。其中，对温度、培养液组成等影响因素的研究较多。本实验选取接种量和溶氧量作为自变量，探究两个因素的不同组合对酵母菌种群数量增长的影响。 2.2 设计实验

（1）确定自变量：

①接种量：0.5ml、 1.0ml、 1.5ml对数生长期酵母菌液。 ②溶氧量：摇床转速210 r/min 、230 r/min、250 r/min。 （2）控制无关变量：营养组分、培养温度、PH值等。

2.3 实施实验

（1）接种与培养

选择已进入对数生长期的酵母菌为实验材料，用移液器吸取设定的接种量（0.5mL、1.0mL、1.5mL），分别接种入液体培养基。震荡摇匀，吸取酵母菌悬液观察计数作为初始值。将接种后的锥形瓶置于不同转速的摇床中，28℃恒温培养。 （2）取样与计数

将锥形瓶中的培养液振荡摇匀，用吸管每隔2h（约1.5-2.0小时芽殖一代）取样1次，共取5次。将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，将酵母菌液由盖玻片边缘滴一小滴，让菌液沿缝隙自行进入计数室，静置5 min。将血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行观察计数。

①如遇酵母菌出芽，芽体大小达到母细胞的1/2时，即作2个菌体计数（图1）。

图1 酵母菌芽殖图（40×10）

②灵活运用五点取样法

血球计数器的规格有两种，一种是汤麦式（25×16型），即1个大方格包含25个中方格、一个中方格包含16个小方格、统计5个中方格；另一种是希利格式（16×25型），即 1个大方格包含16个中方格、一个中方格包含25个小方格、统计4个中方格。统计规则为：记上不记下，记左不记右。

本实验采用的血球计数板规格为汤麦式（25×16型），采用五点取样法，取四角和最中间的5个中方格计数（图2）。

图2 血球计数室

在实验中，最初计数有可能所选取的五个中方格酵母菌总数为零，这时可以不用五点取样法，直接统计中间整个大方格中的细胞总数。 （3）培养液中酵母菌种群密度的计算公式：

酵母菌种群密度（个/ml）=所数小方格中细胞总数×400×l04×稀释倍数/所数的小方格数（汤80/希100）。

2.4 实验结果

（1）数据记录表

将取得的数据汇总填入表1。

表1 酵母菌种群数量随时间变化情况

转速（r/min） 接种量(mL) 时间(h) 0 2 4 6 8 10 0.5 0.11 0.21 0.53 0.89 1.49 1.62 210 1.0 0.23 0.41 1.03 2.15 2.46 2.06 1.5 0.39 0.59 1.28 2.92 3.21 2.16 0.5 0.11 0.37 0.65 1.27 1.87 1.74 酵母菌种群密度（×106个／mL) 230 1.0 0.24 0.58 1.12 2.59 3.18 3.23 1.5 0.41 0.93 2.72 3.48 4.22 4.29 0.5 0.12 0.52 1.02 1.98 2.16 1.97 250 1.0 0.22 0.91 2.48 3.86 3.72 2.92 1.5 0.41 1.37 3.76 4.48 3.98 2.38 （2）绘制曲线

将实验数据输入到Excel表格中，绘制出酵母菌种群数量变化曲线图（图3、图4，纵坐标均为酵母菌种群密度）。

转速：210r/min 230r/min 250r/min

时间（h）

图3 接种量对酵母菌种群数量增长的影响

接种量：0.5mL 1.0mL 1.5mL

时间（h）

图4 转速对酵母菌种群数量增长的影响

（3）结果说明

从图3、图4可以看出，三个转速条件下，随着接种量增加，酵母菌种群数量增长更快，达到的峰值也更高（图3）；接种量相同时，随转速增加，溶氧量增加，酵母菌种群增长率增加（图4）。230r/min、1.0mL，210r/min、0.5mL和230r/min、1.5mL等组合条件下，酵母菌种群数量增长接近“S”型曲线，适合建立种群逻辑斯谛增长的数学模型；其他组合条件下，酵母菌种群数量随时间呈先上升后下降的变化趋势。转速和接种量越大，酵母菌种群

酵母菌种群密度（×106个/mL）

越早进入对数期，达到的峰值也更高。250r/min，接种量为1.0mL、1.5mL时（图3），酵母菌种群数量经历适应期、对数期、稳定期和衰退期。由于转速高提供的氧气较为充足，酵母菌在前期增长速率非常快，达到的峰值较高。当达到峰值后（第6h左右），由于营养、空间等因素的限制，代谢产物增加，种内斗争加剧，经过短暂的稳定期，较早进入衰退期。 3 教学实施建议

3.1 加强使用血球计数板的训练，提高实验技能

学会使用血球计数板计数是本实验的重点，也是后期处理和解释数据、成功建立模型的关键。酵母菌培养初期体积较小，椭圆透明，不易识别，给正确计数增加了难度。可以先选择形态易于观察带有颜色的细胞，如单细胞绿藻、蓝藻等，专门训练学生对血球计数板的使用技能，利于学生较快掌握计数方法。 3.2 血球计数板加样后，静置片刻再观察

如果血球计数板加样后，立即放入显微镜载物台上观察，会造成调节的准焦焦距不同，观察到的酵母菌数量不同。这是因为计数室中的菌悬液有一定的高度（0.1mm），细胞分布在不同液层深度，无法迅速沉降到计数室底部的网格线中。所以，血球计数板加样后，需静置片刻再使用显微镜观察计数。

3.3 酵母菌出现抱团现象，应逐一计数

计数时，有时观察到的酵母菌出现抱团现象，误以为是死菌，不进行统计，这是错误认识。由于酵母菌有很强的絮凝性，很有可能是取样前没有震荡摇匀或培养液中细胞数目过多而造成絮凝。所以，对于成团块聚集在一起的酵母菌细胞，应数出团块中所有的细胞数。

改进建议：①取样前，将锥形瓶中的培养液充分震荡摇匀；取样时，用吸管来回吸取若干次，确保取样均匀。②如果小方格内酵母菌数量过多，对菌液进行适当稀释再计数。一般样品稀释后适宜范围是5～10个菌体／每小格。稀释方法：如lmL菌液欲稀释10倍，则需向lmL菌液中加9mL无菌水。③在实验允许的浓度范围内，可以通过减少接种量或缩短培养时间等方式来适当控制培养液中酵母菌种群密度。 3.4 计数是统计酵母菌活菌总数，需区分死活

对酵母菌计数时，统计的应为活细胞数量，而非细胞总数。计数前期，酵母菌生长时间较短，暂时未出现死亡，大都是活菌。到了后期，种内斗争加剧，菌体会出现部分死亡。实验可以采用吕氏碱性美蓝（亚甲基蓝）染液对酵母菌染色，染色后活细胞呈无色，死细胞或代谢能力微弱的衰老细胞呈蓝色或淡蓝色。统计血球计数板两个计数室中的无色活菌数，取其平均值，代入酵母菌种群密度的计算公式[1]。

（ * 通讯作者）

主要参考文献

[1] 张昊.2010.“探究培养液中酵母菌种群数量变化实验”应注意的几个问题.生物学教学学,35(10):31.