分子生物学名词解释(2) - 图文

类似末端转移酶的活性：非模板依赖 5’-3’外切酶活性：

缺乏3’-5’外切酶活性：无校正功能，错配率增高。

核酸分子杂交：具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下按碱基互补原则退火形成双链。 实质: 核酸变性和具有同源序列的两条单链的复性过程。

核酸分子杂交的原理：具有互补序列的两条单链核酸分子在一定的条件下（适宜的温度及离子强度等）碱基互补配对结合，重新形成双链；在这一过程中，核酸分子经历了变性和复性的变化，以及在复性过程中个分子间键的形成和断裂。杂交的双方是待测核酸和已知序列。

影响杂交的因素：1、核酸分子的浓度和长度：核酸浓度越大，复性速度越快。探针长度应控制在50-300个碱基对为好。2、温度：温度过高不利于复性，而温度过低，少数碱基配对形成的局部双链不易解离，适宜的温度是较TM值低25度。 3、离子强度：在低离子强度下，核酸杂交非常缓慢，随着离子强度的增加，杂交反应率增加。高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定，所以进行序列不完全同源的核酸分子杂交时必须维持杂交反应液中的盐浓度和洗膜液中的盐浓度。 4、杂交液中的甲酰胺：甲酰胺能降低核酸杂交的TM值。它有以下优点：在低温下探针更稳定；能更好地保留非共价结合的核酸。 5、核酸分子的复杂性：是指存在于反应体系中的不同顺序的总长度。两个不同基因组DNA变性后的相对杂交速率取决于样品浓度绝对一致时的相对复杂性（即DNA中的碱基数）。 6、非特异性杂交反应：在杂交前应对非特异性杂交反应位点进行封闭，以减少其对探针的非特异性吸附作用。

探针：指能与某种大分子发生特异性相互作用，并在相互作用之后可以检测出来的生物大分子。 核酸探针：指能识别特异碱基顺序的带有标记的一段单链DNA或RNA分子。

探针的种类和优缺点：1、cDNA探针：通过逆转录获得cDNA后，将其克隆于适当的克隆载体，通过扩增重组质粒而使cDNA得到大量的扩增。提取质粒后分离纯化作为探针使用。它是目前应用最为广泛的一种探针。2、基因组探针：从基因组文库里筛选得到一个特定的基因或基因片段的克隆后，大量扩增、纯化，切取插入片段，分离纯化为探针。3、寡核苷酸探针：根据已知的核酸顺序，采用DNA合成仪合成一定长度的寡核苷酸片段作为探针。4、RNA探针：采用基因克隆和体外转录的方法可以得到RNA或反义RNA作为探针。 探针的标记法1、缺口平移法：2、随机引物法3、PCR标记法4、末端标记法

DNA芯片技术就是一种大规模的集成的固相核酸分子杂交，以大量已知碱基序列的寡核苷酸片段为探针，检测样品中哪些核酸序列与其互补，然后通过定性定量分析得出待测样品的基因序列及表达的信息。其方法包括芯片的制备、样品的准备、分子杂交和检测分子。

SSCP：单链构象多态性检测是一种基于DNA构象差别来检测点突变的方法。相同长度的单链DNA，如果碱基序列不同，形成的构象就不同，这样就形成了单链构象多态性。

1． 研究发现，多聚—L-Lys在pH7.0呈随机螺旋结构，但在pHl0为α螺旋构象，为什么?预测多聚—L-Glu在

什么pH条件下为随机螺旋，在什么pH下为α螺旋构象?为什么?

因为氨基酸侧链基团的带电荷情况会影响alfa-螺旋结构的形成。在pH7．0时赖氨酸侧链上的ε氨基带正电荷，它们之间的静电排斥作用阻止了a螺旋的形成。在pH10时，由于接近赖氨酸的等电点，侧链是非质子化的状态，允许a螺旋的形成。对多聚一L－Glu来说，在 pH7．0时，由于侧链羧基都带负电荷，它们之间的静电排斥，将干扰a螺旋的形成，应呈随机螺旋状态，在接近谷氨酸侧链的pK值为4．25～4．0时，因谷氨酸的侧链羟基是非质子化的，应呈螺旋构象。

5

2． 多聚L-Leu肽段在二氧杂环己烷(dioxane)存在时可形成α螺旋结构，但多聚L-Ile不能，为什么? 因异亮氨酸的β碳原子上有一甲基，干扰了 a 螺旋结构的形成。在亮氨酸分子中，甲基位于γ 原子上，远离主链，不会干扰 a 螺旋结构的形成。

3．一次突变，某蛋白质分子内的一个丙氨酸转变为缬氨酸导致该蛋白质生物活性的丢失；然而在另一次突变时，由于一个异亮氨酸转变为甘氨酸而使该蛋白质的活性恢复了，请分析可能的原因是什么?

第一次突变时丙氨酸转变成了缬氨酸，因后者的侧链较大，使蛋白质的构象改变；另一次突变后由于异亮氨酸转变为甘氨酸，甘氨酸的侧链较小（和丙氨酸相似），补偿了第一次突变造成的影响。 4. 甘氨酸是蛋白质进化中高度保守的氨基酸残基吗?为什么?

Yes甘氨酸是20种氨基酸中侧链最小的一个氨基酸。正因为如此，它的存在使多肽链能形成紧密的盘绕折叠（to make tight turns）或相互靠近。

5．从蛋白质的一级结构可预测它的高级结构。下面是一段肽链的氨基酸排列顺序：“L-A-H-T-Y-G-P-F-Z(Q)-A-A-M-C-K-W-E—A-Z(Q)-P-D-G-M-E-C-A-F-H-R”，问： 1)你认为此段肽链的何处会出现β转角结构? 2)何处可形成链内二硫键?

3)假定上述顺序是一个大的球蛋白分子中的一部分结构，指出D、I、T、A、Z(Q)、K氨基酸残基可能在蛋白质分子的表面还是内部?

4)如果上述序列中第6位的G突变为V，是否会严重影响蛋白质的功能，请说明原因。 1）β转角结构很可能出现在7位和19位，即脯氨酸残基处。 2）13位和24位的半肽氨酸之间可能形成二硫键。

3）极性、带电荷的氨基酸如 AsP，Gln，Lys一般在分子的表面，而非极性的氨基酸如Ala，Ile可能在分

子内部。苏氨酸尽管有极性，但亲水性指数（hydropathy index）接近零，故它可能在分子表面或分子内 一Nothern杂交为什么会出现多个带？ 1 基因转录产物进行了可变的剪接 2该基因是某一多基因家族的成员 3 假阳性,探针的特异性不高 4 杂交条件退火、洗膜等不严谨 5 mRNA有段裂或降解

二、转化实验为什么没有长斑原因及如何设计实验证明哪里出了问题？ 原因有如下几个：1 连接产物不纯，即质粒DNA和目的DNA片段未连接成功 2重组质粒进入感受态细胞出问题，如感受态细胞在高温环境中时间过长而致死 3也可能是培养基质量问题

4也可能是因为受到污染，如培养试剂或是培养基抗性污染 设计实验如下：分三组 阴性对照 阳性对照 正常实验 水 X V X

环状质粒（可以转化进感受态的） V V X

X V X

重组质粒

6

第一种情况原因可能是：连接产物不纯，制备重组质粒的过程出错

第二种情况原因可能是：连水都长菌了，说明存在污染问题，枪头、涂板皿可能被污染。

第三种情况原因可能是:感受态细胞制备出了问题，或者操作上出了问题。，如热激时间不够或者温浴时间不够，都可能造成转化失败

7

8