水稻转基因步骤

在植物转基因过程中，为了有效地识别和筛选转化子，常将目的基因和标记基因构建在同一表达载体中。这种载体结构导致转基因植物中目的基因和标记基因始终共存，而标记基因（尤其是抗生素抗性基因）的存在可能给转基因植物的生物安全带来隐患。目前已研发了多种方法剔除转基因植物中的标记基因，其中最常见的是共转化法(Komari 1996，McCormac等2001)。共转化系统是采用2个质粒或1个含有两套T—DNA表达盒的表达载体共同转化植物，其中一套表达盒含有抗性选择标记基因，另一套表达盒含有目的基因，它们转化植物时可能整合到植物基因组的不同位置。转基因植株在减数分裂过程中，标记基因和目的基因发生分离，从而可在转基因后代中筛选到只含目的基因而不含选择标记基因的个体。共转化从根本上排除了转基因植物中的选择标记，是保证人畜和环境安全的重要措施，因此受到了广泛的重视。Zhou 等（2003）认为，用分别含一个T-DNA区的两个载体共转化的效率低于双T-DNA区表达载体的共转化效率。目前关于利用双T-DNA区表达载体，获得无选择标记转基因阳性株系的研究已有不少报道（唐俐等2006，张秀春等2006，于恒秀等2005）。花药培养与遗传转化技术相结合，可以快速获得纯合转基因植株（斯华敏等，1999，付亚萍等，2001），但是应用花药培养快速获得只含目的基因而无选择标记的转基因研究尚未见报告。

水稻是最主要的粮食作物，转基因水稻的安全显得尤为重要。本实验室通过农杆菌介导的水稻转化体系，将包含人乳铁蛋白(hLF)、高赖氨酸(SB401)、高甲硫氨酸(RZ10)基因的表达载体p13HSR成功转化脆茎稻，由于该表达载体采用双T-DNA结构，将检测出含选择标记潮霉素磷酸转移酶基因（hpt）和目的基因的转基因阳性T0植株按单株直接进行花药培养。在189株二倍体花培植株中检出23株有目的基因没有选择标记hpt的转基因纯合植株，得率为9.87％。RT-PCR检测结果显示外源基因已整合到转基因水稻基因组中并转录。本文首次发现插入的外源基因间存在交换事件，从而改变了花培群体中无选择标记而目的基因阳性的转基因纯系的获得率。同时还对农杆菌介导的同一载体上多个基因转化水稻后，会出现个别基因丢失的情况进行了讨论。

基因转化方法参照Hiei等(1994)的方法并加以修改。取开花后12-15 d左右的稻穗脱粒，表面灭菌后接种在NB培养基上，26℃暗培养诱导愈伤组织。约5-7d后取愈伤组织在相同条件下继代培养，用于共培养。农杆菌于含50mg/L卡那霉素(Kam)的YM平板上划线,28℃黑暗培养3d，用金属匙收集农杆菌菌体,将其悬浮于共培养CM液体培养基中,调整菌体浓度至OD600为0.3-0.5，加入AS（终浓度为100mΜ）,即为共培养转化水稻用的农杆菌悬浮液。将继代培养4d后的愈伤组织浸于此菌液中，20min后取出并用无菌滤纸吸去多余菌液，随即转入铺有无菌滤纸的固体培养基上，于26℃下暗培养2~3d。共培养后的愈伤组织在含有50mg/l潮霉素的筛选培养基上，26℃暗培养14d，再转到新鲜配制的筛选培养基上继续筛选14d。然后选择生长旺盛的抗性愈伤组织转移到含有50mg/l潮霉素的分化培养基上，暗培养3天后转至15h/d光照条件下培养,再生的小苗在1/2MS上生根壮苗两周左右。选择高约10cm、根系发达的小

苗，按编号移栽入土。

将双T载体p13HSR转化脆茎稻，共获得96株转基因苗（T0代）。PCR检测表明其中41株既含潮霉素抗性基因又含目的基因，42株只有潮霉素抗性基因没有目的基因，4株有目的基因没有潮霉素抗性基因，9株目的基因和潮霉素抗性基因都没有。双T-DNA区表达载体p13HSR在水稻中的共转化频率为42.7％。没有选择标记的13株（13.5％）T0代转基因苗，是逃过抗生素的抑制幸存下来的，从技术上和理论上都无法控制其出现频率，即使含有目的基因也没有实际操作价值。所以我们在实验中挑选了目的基因和选择标记都有的T0代植株进行后续的花培纯合实验。

从先期获得的6株T0植株中，检测出5株同时含选择标记基因和目的基因。将这些植株按单株进行花药培养，共获得花培苗233株，其中189株二倍体，7株四倍体，37株单倍体。二倍体植株的PCR检测结果表明，有68株既含潮霉素又含目的基因，24株只有潮霉素没有目的基因，74株目的基因和潮霉素都没有，23株有目的基因没有潮霉素。无选择标记而目的基因阳性的转基因纯合植株的总得率为9.87％，这些植株生长正常，株高、分蘖、穗长、单穗粒数等参数和对照相仿（资料未显示）。 RT-PCR检测结果显示外源基因已整合到转基因水稻基因组中并转录（图2，3）。以上结果表明，将遗传转化技术与花药培养相结合，快速获得了纯合的，同时含人乳铁蛋白(hLF)、高赖氨酸(SB401)、高甲硫氨酸(RZ10)基因但不含潮霉素抗性基因的二倍体转基因水稻（图4）。 2.3 DHT0代群体中选择标记基因和目的基因的分离

5株T0转基因株分别进行花药培养，获得5个DHT0代群体。对群体中的二倍体植株进行了目的基因（为方便计，记作G)与选择标记基因（S）的PCR检测。结果表明5个株系中都 有S+G+，S+G-，S-G+和S-G-四种类型的植株。假定在农杆菌转化过程中，2个T-DNA分别独立插入到水稻基因组的不同源的染色体上，则其花培群体的分离比应为1：1：1：1。卡 平方测定结果（表2）表明，1、3、5号群体的分离比符合预期假设，但2、4号群体的分离比与预期结果不符，而且S+G+和S-G的比例明显高于S+G-和S-G+，提示双T结构可能插入到同源染色体的同一染色单体上，并在减数分裂期间发生了遗传交换。由于花药培养获得的DH群体直接反映了交换事件，因此2、4号群体的交换频率分别为18.0％和28.6％。 2.4 双T-DNA区三价表达载体在转化过程中部分目的基因的丢失

在对T0代和DHT0代进行选择标基因及目的基因检测的过程中，发现处于同一T-DNA区不同启动子启动的三个目的基因，在转基因植株中的出现频率也不是完全一致的。T0代的45株目的基因阳性株系PCR检测结果表明有1株包含hLF无SB401和RZ10，1株无hLF有SB401和RZ10。RT-PCR结果显示：DHT0代的91株中有6株有hLF无SB401和RZ10，3株无hLF有SB401和RZ10（图5）。

植物转基因对改良植物品质、增加抗性、提高产量等方面，都具有明显作用。尽管WHO（1991）

和FDA（1994）已经声明，食物中的标记基因本身并无安全性问题，但是从转基因作物的食用和环境安全性考虑，人们对抗性基因是否有向其他生物转移的可能性仍有诸多疑虑(Widmer等1996，1997；Kohli等1999)。此外，就育种方法而言，转基因品种中标记基因的存在，对它再次进行转基因聚合育种也带来一定困难（Yoder and Goldsbrough 1994）。因此，转基因植物标记基因的剔除，是转基因育种的一个重要内容。本研究表明利用双T载体转化水稻，再通过花药培养技术即可快速获得有目的基因却不含选择标记的转基因株系，有效消除选择标记基因的安全隐患，大大加快了研究成果的应用速度。在本研究中，无选择标记而目的基因阳性的转基因纯合植株的得率为9.87％。于恒秀等（2005）用双T-DNA双元载体转化水稻，T0代共转化阳性的转基因植株自交后得到T1代植株中无选择标记基因而有目的基因AP1的比例介于25%-33%之间。张秀春等（2006）利用双T载体获得的无选择标记的转基因大豆， T1代无选择标记基因而有目的基因的比例为18.75%，用同样的方法，Zhou等（2003）报告T1代的无选择标记基因而有目的基因的比例为19.5%。由于这些T1代的目的基因存在纯合与杂合两种情况（比例约为1：2），因此虽然纯合基因型的比例与本实验基本一致，但还需要继续加代和检测才能获得纯合的植株。而将双T载体转化与花药培养相结合的方法，仅

一代就可获得纯合目的植株，大大加快了研究进度。

双T载体转化水稻在T0代有五种插入可能：1.选择标记区（简称S区）和目的基因区（简称G区）仍然相连，或者虽不相连，但插入在同一染色体的同一染色单体上；2. S区和G区分离，分别插在同一染色体的两个姐妹染色单体上；3.S区和G区分离，并分别插在不同的染色体上；4.S区发生T-DNA插入事件，G区被丢掉；5. G区发生T-DNA插入事件，S区被丢掉。选取S+G+的T0代进行花药培养，淘汰了后两种情况，前三种类型在花培的DHT0代植株中又会出现新的分离情况（如表3）。在已有的报道中，选择标记基因与目的基因的分离比数据所体现的均为表3中各种类型综合后的结果，无法明确双T载体的插入方式。而本实验中我们选取了选择标记和目的基因双阳性的T0代植株并按株系进行花药培养，虽然进行花药培养的单株不多，也检出了3个T-DNA结构插入不同染色体（1，3，和5号群体）和同一染色单体（2和4号群体）两种类型，表明通过对DHT0群体的检测，有可能分析双T-DNA结构在转基因中的行为，为转化后载体插入方式的理论研究奠定了基础。当然，个别DHT0群体的二倍体植株较少，可能影响生物统计的结论，因此今后开展同类研究需要保证一定的群体规模。

转化一、两个外源基因，往往不能满足育种上对多项农艺性状的要求，而多次转化又面临时间长，选择标记缺乏等难题，所以研究人员把多个外源基因一次性转入受体材料。Cao等（2005）将多元载体pYP1203E转化水稻，该载体在同一T-DNA区包含选择标记基因（hpt），报告基因（GUS）以及另外的三个各自独立使用启动子，终止子的外源基因（VHb，tzs和EPSPS），在113株T0代转基因单株中发现有8株发生了一个或两个外源基因丢失的情况。

本研究45株目的基因阳性的T0代株系中也有2株出现了部分目的基因丢失，所以我们推测大片段的T-DNA区在转化过程中会发生不完整插入的现象。DHT0代91株中有9株目的基因片段不完整，说明较长的插入片段在后代遗传过程中有丢失其中一个表达盒的可能，由于基因转录必须具有完整的表达盒，所以RT-PCR结果显示的是hLF的缺失或是SB401和RZ10的缺失。载体p13HSR中，共用启动子的SB401和RZ10表达盒是否会出现丢失其中一个基因，另外一个正常表达的情况，我们的实验结果不能体现，这是因为，RZ10是一个水稻内源的高甲硫氨酸含量的基因，为了便于检测，我们用SB401的序列设计了RZ10的5’端引物，用RZ10的序列设计了3’端引物，所以SB401和RZ10在我们的检测结果中始终是连锁的。对这种可能性的研究需要构建其他特异的表达载体，转化受体材料后，进行分析。我们的研究提示在作物育种过程中引入太大的表达载体可能并不合适，为了将多个基因组合在一起，需要探索更加切实可行的方法。

中国是水稻生产大国，随着育种技术的不断进步，水稻产量大幅增加，但是在收获稻谷的同时也收获了稻草，以收获指数为0.5匡算，每年收割的稻草达2亿吨。面对如此巨量的副产物，农民没有相应的回收利用措施，只好田间焚烧，不仅严重污染环境，而且每到秋收季节，浓烟弥漫，机场被迫关闭，造成重大经济损失和不良社会影响；另一方面，我国南方大多数地区的畜牧饲料匮乏，需要依靠外地调入甚至是进口，而稻草虽然营养全面，却因纤维含量过高，不易被动物分解利用，只能付之一炬。本研究将乳铁蛋白、赖氨酸和甲硫氨酸导入水稻脆茎稻。期望通过转基因提高秸秆的营养价值，从根本上打破烧秸秆—污染环境—缺饲料的农业怪圈，促进农业的可持续发展。目前正在测定外源基因在转基因株系中的表达产物，数据将另行发表。