蛋白浓度测定

蛋白浓度测定

BCA法测定样品蛋白的浓度

1、原理：在碱性环境下，蛋白质分子中的肽链结构能与Cu2+ 络合，将Cu2+还原成Cu+。BCA 试剂可敏感特异地与Cu+结合，形成稳定的有颜色复合物。在562nm处有高的光吸收值，颜色的深浅与蛋白浓度呈正比。通过制备经过梯度稀释的、浓度抑制的一组蛋白质标准品，然后将其与未知浓度的待测蛋白质仪器检测，根据绘制出的标准曲线，计算样品中的蛋白浓度。

2、准备：96孔板、枪（枪头）、酶标仪（提前开启）、Pierce的BCA蛋白定量分析试剂盒、PBS、蛋白标准品（-20℃分装保存）、PBS缓冲液、待测蛋白样品。注意：蛋白标准品有两种：一种是BCA试剂盒原装蛋白标准品（2mg/ml），另一种是10mg/ml蛋白标准品，需要稀释到2mg/ml。

3、操作步骤：

①准备1ml RIPA裂解液：加100μl phosstop、10μl cocktail和10μl PMSF到 880μl 1X RIPA buffer中，混匀后置于4℃中备用。（若蛋白提取完后直接进行蛋白定量，则可直接用剩余的裂解液。）

②准备BSA标准品：Pierce BSA原浓度为2 mg/ml，取5个200μl EP管按下表配好标准品。

Standard (μg): BSA stock (μl) 0μg 1μg 2μg 5μg 10μg

Water (μl) lysis Buffer w/inhibitors (μl) 0μl 2μl 4μl 10μl 20μl 32 30 28 22 12 8 8 8 8 8

设置好每孔所加样品后（如下表）： 96-well plate A B C D E F G H 1 标曲0μg 标曲1μg 标曲2μg 标曲5μg 标曲10μg Sample 1 Sample 2 Sample 3 2 标曲0μg 标曲1μg 标曲2μg 标曲5μg 标曲10μg Sample 1 Sample 2 Sample 3 3 Sample 4 Sample 5 Sample 6 Sample 7 Sample 8 Sample 9 Sample 10 Sample 11 4 Sample 4 Sample 5 Sample 6 Sample 7 Sample 8 Sample 9 Sample 10 Sample 11 5 Sample 12 Sample 13 Sample 14 Sample 15 Sample 16 Sample 17 Sample 18 Sample 19 6 Sample 12 Sample 13 Sample 14 Sample 15 Sample 16 Sample 17 Sample 18 Sample 19 7 Sample 20 Sample 21 Sample 22 Sample 23 Sample 24 Sample 25 Sample 26 Sample 27 8 Sample 20 Sample 21 Sample 22 Sample 23 Sample 24 Sample 25 Sample 26 Sample 27 9 Sample 28 Sample 29 Sample 30 Sample 31 Sample 32 Sample 33 Sample 34 Sample 35 10 Sample 28 Sample 29 Sample 30 Sample 31 Sample 32 Sample 33 Sample 34 Sample 35 11 Sample 36 Sample 37 Sample 38 Sample 39 Sample 40 Sample 41 Sample 42 Sample 43 12 Sample 36 Sample 37 Sample 38 Sample 39 Sample 40 Sample 41 Sample 42 Sample 43

③涡旋混匀标准品，每个加10ul （横排并列第二个做复孔）。 ④涡旋混匀待测蛋白，每个加1ul （横排并列第二个做复孔）。 ⑤加140ul水到标准品孔，149ul水到待测样品孔。

⑥根据数量（标品5*2个+待测样品n*2个），按A:B=50:1配制BCA工作液，每孔100ul。（若需5ml，则5ml A液 + 100ul B液）

⑦用保鲜膜覆盖孔板后，再盖上孔板盖子，置于60℃孵育20min，在酶标仪540-570 nm (562 nm) 处读值。 4、注意事项：

①在加标准蛋白或样品蛋白时，应用相应量程的枪头对溶液进行充分的混匀，以降低因溶液浓度不均对实验造成的影响。

②在操作过程中，对枪的量取要细心，防止枪头内残余太多标准蛋白样品，影响标准曲线的绘制。

③此法测浓度，所加的标准品及样品的量都极少，在操作过程中，在吸取标准蛋白及样品时，尽量只让枪头的口接触液面吸取，以减少实验误差。

④使用排枪加液体时要注意观察排枪所吸取液体的体积是否一致，加入孔中时避免打出气泡，干扰酶标仪测定。

⑤测浓度要求精确，否则会导致上样量不一致，所以每个样品都要换枪头。