wnt信号通路与cd133阳性细胞关系

-A，这一发现促使我们探讨在创面，CD133 +细胞是否通过旁分泌机制激活Wnt信号通路。

为了这个目的，我们筛选了在CD133 +细胞治疗糖尿病伤口调控的Wnt基因。RNA是提取术后3天收集的组织并定量RT - PCR检测。 Wnt4，Wnt5A，Wnt5B，Wnt7A和Wnt7B基因存在于所有伤口样本（数据未显示）。有趣的是，在CD133 +细胞治疗的伤口比任何CD133 -的细胞或胶原处理伤口，只有Wnt7A表达增加（在线图八）。

下一步，我们评估通过祖细胞Wnt信号如何参与促进血管生成。人脐静脉内皮细胞在高糖培养条件下表达Wnt2B，Wnt3，Wnt4，Wnt5A，Wnt9A，并在较小范围上，表达Wnt8B和Wnt16（数据未显示）。脐静脉内皮细胞接触CD133 + CCM后，我们观察到的Wnt3，Wnt5a，以及Wnt9A的显示增加（比CD133-CCM或NCCM）（在线图九）。重要的是，抗血管内皮生长因子- A抗体的CD133 + CCM阻止了CD133+CCM中的Wnt3，Wnt5A，Wnt9A诱导作用（数据未显示），因此这意味着血管内皮生长因子-A能够调控Wnt信号表达。

验证体内的Wnt信号的重要性，我们下一次在敷在糖尿病伤口上的CD133+ CCM中加入Wnt的拮抗剂sFRP。重要的是，sFRP – 1阻止了CD133 +CCM修复创面促进血管生成的作用（图6）。符合体内数据，在体外sFRP - 1的存在阻止了CD133+ CCM促进内皮细胞的网状形成的作用（在线图十）。然而，如果

sFRP - 1添加到NCCM，能够不影响血管内皮细胞网络的形成。21同样，由于sFRP – 1作用，CD133 + CCM诱导血管内皮细胞迁移能力减弱（在线图十一）。在高糖条件的CD133 + CCM中的sFRP – 1对血管内皮细胞存活没有影响（数据未显示）。为了进一步阐明CD133 + CCM的调解下Wnt信号传导机制，在DKK – 1存在与否的情况下，我们研究网络的形成，伤口愈合以及内皮细胞的存活。 DKK - 1通过结合LRP抑制经典的Wnt通路，LRP是从via kremen蛋白质膜移除的。29 DKK - 1减少CD133 +CCM促进了血管内皮细胞网络的形成的倾向（在线图十），然而CD133 +CCM促进血管内皮细胞伤口愈合不受DKK- 1加入的影响（在线图十一）。在受到CD133 + CCM刺激的内皮细胞，我们进行了一个荧光分析发现β-连环素诱导通过结合Tcf/Lef分子完成基因表达。出人意料的是，我们没有发现转录激活在应对中CD133 +或CD133-的CCM（在线图11），从而表明了β- catenin不参与CD133+诱导效应的机制。

讨论

最近的临床前的干细胞治疗糖尿病小鼠肩胛骨间区域的穿通伤试验很受人们关注。 6，8，30 糖尿病患者，这种病变是由于不小心的意外造成的创伤，经过休息和常规治疗很容易治愈。因此，这些可喜的成果对于缺血性足溃疡的效果还不确定。为了恢复这种类似于缺血性糖尿病足的情况，我们开发了一种新模式，切除全层糖尿病小鼠缺血肢体的伤口。我们证实了糖尿病与

缺血的综合作用在伤口愈合过程中产生不好的作用。在此模型中，促进血管生成因子的细胞的移植，（从健康捐赠者外周血的单个核细胞分化来的），无法促进伤口愈合（P. Madeddu, L.Barcelos, unpublished observation, 2008）。我们评估以前被证明是治疗性肢体缺血模型中有效的胎儿祖细胞，13能否在成年细胞失败的模型中成功。除了CD133之外，这些胎儿细胞干祖细胞标记表示不仅仅有CD133-的后代，如TERT，Syk和uPAR，这些以往介绍过的参与干细胞维持，血管新生，血管发生。31-35

虽然胎儿的CD133 +细胞表达Wnt，有利于分化，他们表达Wnt4和Wnt7A减少和sFRP - 1，sFRP - 3和sFRP – 4的增加。有趣的是，sFRP - 1能够减少胎儿干细胞CD133的表达，没有诱导成熟的内皮细胞标记。由于复杂的信号事件引导分化，我们不会期望CD133 -的细胞表型相同的模拟Wnt的拮抗剂的存在。但是，在CD133的表达下降，在我们的模型中验证CD133 +需要依赖Wnt信号，因为其他干细胞已被证实。36，提示Wnt的拮抗剂可能在分化的最初阶段忽略Wnt产生的阴性对照37 stemness的维持与临床前试验的结果有关：局部给予CD133 +细胞能够促使糖尿病下肢缺血性溃疡愈合加快，而给予CD133 -的细胞是无效的。

糖尿病患者伤口与和不良是由多种因素造成的，包括血管新生能力弱，26,38以及控制细胞存活混乱39，因此这可能有临床

相关性的，胎儿CD133 +细胞移植恢复修复小鼠糖尿病溃疡处的血管新生，刺激内皮细胞的生存，增殖，迁移。

细胞疗法的效果依赖于有足够的适用细胞到靶组织中并且有产生促进愈合物质的能力.10应用体内成像方法，在大多数实验和临床研究证明归巢的程度是相当低（综述别处40）。同样的，应用3种不同实验方法，我们发现在糖尿病伤口混合有少量的CD133+细胞，可能是由于不利的环境而产生的。我们的数据没有排除，在不同的环境下，血管内皮祖细胞可能是直接促进修复血管生成，正如我们以前所支持的意见，肌肉注射胎儿CD133 +细胞能促进肢体肌肉新生血管。13

糖尿病伤口治疗后的短期时间里，我们有理由认为CD133 +细胞的施加在愈合方面起到了良好的效果，是通过治疗性因子的突然释放或是对靶组织持续旁分泌的刺激，如以前所报告的其他 祖细胞。9我们详细说明了由CD133+产生的细胞因子和生长因子的复杂的混合体。内皮祖细胞所释放的物质很相似。41，但在胎儿CD133 +CCM发现更高浓度物质，从而说明这些细胞有促进愈合的潜力。我们发现，CD133+ CCM能够诱发人内皮细胞的迁移和存活。血管内皮生长因子-A，白细胞介素6和IL – 8的中和抗体能够阻止血管内皮细胞迁移，但不阻止CCM对高糖诱导的细胞凋亡的保护作用（数据未显示）。在之后的现象中，Akt - FOXO途径似乎有所牵连，因为内皮细胞转染阴性的Akt减少在高糖条件下CD133+CCM介导的生存率。在CD133 +