PCR反应体系

在150μl的Eppendorf管中依次加入： ddH2O 12.25μl 10×PCR buffer 2μl 10mM dNTP mix 1μl Taq 0.25μl Primer 1 1 μl Primer 2 1 μl

基因组DNA 2μl（10-50ug/ul，如果高于此浓度需要稀释） 以上先配好混合，分装，在分别加入基因组

基因组DNA（2μl如果浓度太大稀释10-100倍） Total（20μl）

充分混匀后，于PCR仪中进行扩增反应。 PCR的扩增参数为：

95℃预变性5min，94℃变性45 s，62℃退火45s ，72℃延伸1 min30s，30个循环后，72℃延伸7 min。将扩增后的目的片段在电泳缓冲液、1%琼脂糖凝胶、和90V电压条件下电泳30min，以检测其大小、纯度和亮度。 注：

当模板DNA的GC含量为55%或更低的线性DNA时我们推荐常规PCR的变形条件是94-95变形45s。当DNA的GC含量超过55%时需要更高的变形温度。 退火温度低于60有很多非特异扩增，测序的时候条带会很乱。 如果退火温度太高引物不能与模板很好地复性。复性温度通常在比理论计算的引物和模板的溶解温度低3-5度的条件下进行。最好通过对复性温度比两条寡核苷酸引物的溶解温度按低2-10度范围内进行系列PCR预实验来对复性条件进行优化。 对Taq酶来说最适延伸温度为72-78℃。