木瓜蛋白酶的开发与应用

木瓜蛋白酶的开发与应用

作者：吉财（学院：制药工程 专业：制药工程）

[摘 要]研究了木瓜蛋白酶生产工艺中的几个重要环节G 结果表明: 用丹宁沉淀法既可提高产 品产量 又可保持产品质量; 硫代硫酸钠和半胱氨酸是木瓜蛋白酶活性的有效保护剂 可使酶活性比 对照提高2. 39倍; 提取过程中用抗坏血酸~ EDTANa2 和氯化钠可有效地提高产品的活性和质量G

关键词：木瓜蛋白酶；木瓜凝乳酶；固定化酶；嫩肉粉

The development and application of papain

The author：jicai（College：Pharmaceutical engineering Pofessional:Pharmaceutical

engineering )

[Pick to]Papain were studied in the process of production of several important links G results show that with tannin precipitation can improve products production and can keep the quality of the products; Sodium thiosulfate and cysteine is the activity of papain and effective protective agent Higher than that of contrast can make the enzyme activity 2. 39 times; Extraction process with ~ EDTANa2 ascorbic acid and sodium chloride can effectively improve the product quality of activity and G Key words:Papain;Papaya rennet; Immobilized enzyme; Tender meat powder 木瓜蛋白酶（papain）来源于未成熟番木瓜（Carica papaya）果实的新鲜乳汁，是一种含疏基（-SH）肽链的内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力；同时还具有合成的功能，能把蛋白水解物合成为类蛋白质。工业用的木瓜蛋白酶一般都是未经纯化的多酶体系。现已知经木瓜乳汁干燥而得的木瓜蛋白酶至少含有四种主要酶类：木瓜蛋白酶（papain）、木瓜凝乳蛋白酶（chymopapain）、木瓜蛋白酶Ω（papaya proteinaseΩ）、木瓜凝乳蛋白酶M（chymopapain M）[1]，其中木瓜凝乳蛋白酶的含量最多，占可溶性蛋白的45%。木瓜蛋白酶易溶于水和甘油，水溶液为无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于有机溶剂。它的最适pH值为5.7（一般3～9.5皆可），在中性或偏酸性时亦有作用；最适温度为55～60℃（一般10～85℃皆可），耐热性强，在90℃时也不会完全失活；受氧化剂抑制，还原性物质激活。

1 木瓜蛋白酶的分离与纯化

1.1木瓜蛋白的组分 \\

工业用的木瓜蛋白酶一般都是未经纯化的多酶体系。由木瓜乳胶提取粗制酶,除含有木瓜蛋白酶外,还含有半耽氨酸蛋白酶、纤维素酶、溶菌酶、谷氨酞胺以及

低相对分子质量的疏基化合物,还有葡萄糖酶等。其中大部分都是疏基蛋白酶,主要的两种组分是木瓜凝乳酶和木瓜蛋白酶[2] 。

1.2木瓜蛋白酶的提取工艺 1.过去的常规提取方法

木瓜蛋白酶最原始的提取方法是烘干法，就是在番木瓜浆液中加入保护剂，然后将浆液离心取上清液放置于鼓风干燥箱中，在55～60℃烘干，粉碎后即得到粗酶制品。乙引等用这种方法所获得的酶得率为23.1%，但此法不利于酶活的保持，其酶活力仅为0.16×105U/g，而且产品的纯度较低[4] 。

木瓜蛋白酶的提取也曾广泛采用单宁沉淀法，乙引等用单宁沉淀法提取了木瓜蛋白酶。先将番木瓜乳汁离心，于上清液中缓慢加入已溶解的单宁溶液，不断搅拌，使溶液中单宁达到一定浓度。静置，沉淀单宁-酶复合物，调节pH值，沉淀后进行真空干燥，得到酶制品。结果表明，这种方法生产的酶得率较低，仅有7.3%，但酶活力较高，为3.53×105U/g。但是这种方法存在环境污染等问题。木瓜蛋白酶的提取也曾广泛采用单宁沉淀法，乙引等用单宁沉淀法提取了木瓜蛋白酶。先将番木瓜乳汁离心，于上清液中缓慢加入已溶解的单宁溶液，不断搅拌，使溶液中单宁达到一定浓度。静置，沉淀单宁-酶复合物，调节pH值，沉淀后进行真空干燥，得到酶制品。结果表明，这种方法生产的酶得率较低，仅有7.3%，但酶活力较高，为3.53×105U/g。但是这种方法存在环境污染等问题。 2.目前较为常见的提取方法

目前生产中多采用超滤、絮凝、盐析等方法分离提取木瓜蛋白酶。 2.1 超滤法提取木瓜蛋白酶

用超滤技术纯化木瓜蛋白酶。先将中空纤维超滤膜洗净, 然后取一定量絮凝处理后之清液, 控制一定压力和流量, 进行超滤。在超滤过程中被截留, 而水及小分子杂质透过膜, 从而达到浓缩和纯化的目的, 试验截留率可达93% 以上。超滤过程操作条件温和, 无相变化，不易引起生化物质破坏, 是一种较好的分离技术

[5]

。

2.2 盐析法提取木瓜蛋白酶

曾用硫酸铵沉淀法分离木瓜蛋白酶。在粗酶液中加入一定浓度的硫酸铵溶液进行盐析，然后调pH值，离心取沉淀，干燥，得酶产品。实验结果表明，用该法制备的木瓜蛋酶纯度相对较高，酶的比活力达到了1184U/mg，适宜作为化妆品成分。但这种方法由于用了大量的盐，使酶中灰分增加，同时降低了木瓜蛋白酶的活性。因此，盐析法并不是理想的木瓜蛋白酶提取方法 。 2.3 絮凝法分离纯化木瓜蛋白酶

絮凝法是在木瓜乳胶水提取液中添加某种化合物，该化合物能与木瓜蛋白酶生成难溶性的复合物，从而使酶从溶液中沉淀析出,研究了用絮凝技术纯化木瓜蛋白

[6]

酶。实验结果表明，在适宜的条件下进行絮凝处理，可使木瓜蛋白酶在这步的收率达95～97%。但这种方法提取专一性不强，制得的木瓜蛋白酶纯度不高，杂质含量较高[7] 。

3木瓜蛋白酶的提取新技术

3.1超声波法提取木瓜蛋白酶

超声波提取法作为一种新型的提取技术已经比较广泛地应用于天然植物有效成分的提取。超声波产生的空化效应，一方面赋予溶剂对细胞壁更大的渗透力，并强化细胞内外的质量传输，另一方面破坏细胞壁，使细胞内含物更易释放，从而强化了提取过程[19]。

4木瓜蛋白酶的固定化

由于木瓜蛋白酶价格昂贵且无法重复利用，促使人们研究和制备固定化木瓜蛋白酶。固定化的木瓜蛋白酶可以避免其在酸碱和有机介质中失活，实现酶的 反复利用，达到节约生产成本的目的。常用的固定化方法有吸附、载体交联和包 埋法。 4.1 吸附法

利用固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面而 使酶固定化的方法称为吸附法。常用的吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔 陶瓷、多孔玻璃、硅胶、 羧基磷灰石等。磷酸缓冲液处理后的多孔陶瓷膜 作为固定化酶的载体，采用物理吸附法固定木瓜蛋白 酶。结果表明，当溶液酶质量浓度为1.0～2.0mg/mL、pH为7.0、固定2h时，固定化酶的活力最高可达111.1U/g，活力回收达57.9%，半衰期为54d。 4.2 载体交联法

交联法是采用双功能试剂使酶分子之间或酶分子与固相载体之间发生交联作用 而制成固定化酶的方法。常用的双功能试剂有戊二醛、己二胺等[14]。以壳聚糖为载体、戊二醛为交联剂固定化木瓜蛋白酶，研究结果表 明壳聚糖固定化木瓜蛋 白酶的最佳条件为：壳聚糖浓度2.5%，加酶量0.3g/g载体，时间6h，温度15℃，pH7.5，酶活力回收率38.98%。固定化酶重复使用五次，酶活力仍保持50% 以上 4.3 包埋法将酶或含酶菌体包埋在多孔载体中，使酶固定化的方法称为包埋法

[15]

[13]

。采用微孔淀粉-海藻酸钠包埋法固定化木 瓜蛋白酶，结果表明，最佳固定

化木瓜蛋白酶制备条件为微孔淀粉浓度4%，海 藻酸钠浓度3%，CaC12 浓度5.5%。此时固定化木瓜蛋白酶的最适pH值为5.7，最适温度72℃，其耐热性、操作稳定性、机械强度都不同程度增加，操作成本低 适合工业推广。 4.4 其他新方法

近几年来人们不断地开发新型的固定化载体和新方法，取得了较好的成果[16]。以氧化硅介孔泡沫材料为载体对木瓜蛋白酶进行了固定，结果表明，固定化木瓜蛋白酶的最 适反应温度较游离酶提高 了10℃，最适pH值向碱性方向偏移0.5个单位，酶活保留65.1%[17]。对高沸醇木质素和酶解木质素进行化学改性，以增加木质素的亲水性，制得新型 高 聚物高沸醇木质素酚（HBS木质素酚）和木质素氨基酚衍生物，对木瓜蛋白进 行了固定化的研究，结果 表明，木瓜蛋白酶被酶解木质素氨基酚和 HBS木质素酚吸附时活性回收率达到 50%以上，有望成为固定化 酶的优良载体。

5、木瓜蛋白酶在食品加工业的应用

5.1焙烤食品：将木瓜蛋白酶加入生面团中，可使面筋降解，生面团被软化后易于加工，并能提高饼干与面包的口感与品质。

5.2啤酒酿造：应用于啤酒酿造工艺流程中能降低麦芽用量，提高麦汁氨基氮（提供酵母生产氮源），促进发酵双乙酰的降解，使啤酒澄清防冻、阻止冷藏过程中啤酒冷浊形成，效果显著。

5.3干酪：木瓜蛋白酶用于干酪素的凝结。

5.4肉类的嫩化：木瓜蛋白酶将肉类蛋白质的大分子蛋白质水解为易吸收的小分子氨基酸和蛋白质。可用于各类肉制品的精加工（制成牛排肉坯、鸡精等）、肉类的嫩化、处理老韧筋杂肉类等。 5.5水产品深加工：如水解珍珠蛋白。

5.6淀粉糖工业：原料经液化后，加入木瓜蛋白酶，原料保温糖化[18]。 5.7木瓜蛋白酶在其它食品加工业中的应用，亦正在被广泛地研究与开发，如增加豆饼和豆粉的PDI值和NSI值，生产可溶性蛋白制品及含豆粉的早餐、谷类食物和饮料；脱水豆类；婴儿食品和人造黄油；澄清苹果汁；制造软糖；蛋与蛋制品；促消化保健食品及其他医药品等[8]。

6、广州华琪的木瓜蛋白酶的应用案例和工艺技术分享

广州华琪（原广州酶制品厂）自1985年生产和应用木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶方向的应用方案和工艺技术已经非常纯熟。多年来广州华琪生产的大量鸡肉类提取物已得到市场的广泛认可。现将工艺技术和应用案例分享如下： 6.1木瓜蛋白酶应用在肉类水解，如猪肉、鸡肉、海鲜肉类等。 ?

肉类嫩化 牛肉、羊肉或猪瘦肉切薄片或小块，按200U/g~400U/g肉将本品添加到清水或其他腌制料中，常温下腌制30~50min或在40~60℃下腌制10~25min，可使粗糙、老硬的肉类变得细嫩爽滑、鲜美醇厚[20].鸡肉水解鸡骨架绞碎，加水1~2倍，按800~2000U/g鸡骨架添加本品，50℃~65℃下搅拌酶解2~4h可以将蛋