微量凯氏定氮法测定蛋白质含量实验报告

微量凯氏定氮法测定蛋白质含量实验报告

一、实验目的

1.学习微量凯氏定氮法的原理

2.掌握微量凯氏定氮法的操作技术（未知样品的消化、蒸馏、滴定及其含氮量的计算等）

二、实验原理

凯氏定氮法常用于测定天然有机物（如蛋白质，核酸及氨基酸等）的含氮量。

当天然含氮有机物与浓硫酸共热时，其中的碳、氢被氧化成二氧化碳和水，而氮则变成氨并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。此过程称为“消化”。

此过程进行的相对较为缓慢，通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高溶液的沸点，并加入硫酸铜作为催化剂，以促进反应的进行。氧化剂过氧化氢也能加速反应。

消化过程：

2NH3?H2SO4?(NH4)2SO4含氮有机物?H2SO4?CO2?SO2?H2O?NH3

蒸馏：在消化完全的样品溶液中加入浓氢氧化钠使呈碱性，加热

蒸馏，即可释放出氨气。

反应方程式如下：

(NH4)2SO4?2NaOH?Na2SO4?2NH4OH

吸收与滴定：蒸馏所放出的氨，可用硼酸溶液进行吸收，待吸收完全后，再用盐酸标准溶液滴定，直至恢复溶液中原来氢离子浓度为止（即滴定至蓝紫色)，最后根据所用标准酸的当量数（相当于待测物中氨的当量数）计算出待测物中的氮量。

NH3?H3BO3?NH4H2BO3

NH4H2BO3?HCL?NH4CL?H3BO3

三、实验试剂、材料和器材

实验材料：食用面粉。

实验试剂：浓硫酸、30%氢氧化钠溶液、克氏催化剂、2%硼酸、指示剂、0.01M HCL。

实验器材：凯氏烧瓶、电炉、凯氏定氮蒸馏装置、锥形瓶、100ml容量瓶、酸式滴定管。

四、操作步骤

1.消化

（1）准确称取1克食用面粉，用称量纸卷好小心送入至50毫升的凯氏烧瓶底部，切勿沾于瓶口或瓶颈上；

（2）向另一烧瓶加入1ml水作空白对照；

在每个烧瓶内加入硫酸钾—硫酸铜混合物（克氏催化剂）少许，浓硫酸10ml，小瓷片两粒，摇匀；

（3）将烧瓶约60度角固定在铁架上，每个瓶口放一小漏斗，在通风厨内的电炉上消化；

（4）在消化开始时，应控制火力，不要使液体冲到瓶颈； （5）待瓶内水汽蒸完，硫酸开始分解并放出SO2白烟后，适当加强火力，继续消化，直至消化液呈透明绿色为止；

（6）消化完毕，待烧瓶内容物冷却后，加蒸馏水10ml（注意慢加，边加边摇）；

（7）冷却后将瓶中内容物转入100ml的容量瓶中，并用蒸馏水洗烧瓶数次，溶液一并倒入容量瓶，最后定容至刻度摇匀，做上记号备用。

2.蒸馏

（1）蒸馏器洗净后，开放水龙头P3，使水进入A室，水放至A室球部2/3处即可。

（2）取3个50ml的锥形瓶，分别加入10ml硼酸（内加有混合指示剂）。用表面皿复盖备用。

（3）加样

① 用移液管吸取2ml消化液，小心地由漏斗D倾入B室； ② 取一个盛有硼酸的锥形瓶，置于M管下，使管口恰好接触

硼酸溶液，用量筒从漏斗D加入30%氢氧化钠5ml，随即将P4夹紧，并往漏斗加入少量蒸馏水封闭。

（4）蒸馏

① 用酒精灯加热，维持火力恒定，沸腾不可高于Y管口以免A室溶液从Y管倒吸，待第一滴蒸馏液从冷凝柱F顶端滴下时起，继续蒸馏5分钟；

② 然后将锥形瓶放低，使导管离开液面再蒸2分钟，最后用蒸馏水洗导管外壁，蒸馏完毕，取下锥形瓶准备滴定。

（5）空白蒸馏

① 用移液管分别吸取2ml蒸馏水按上述操作步骤进行蒸馏。 仪器的洗涤： 3.滴定

（1）蒸馏完毕，用微量酸式滴定管，以0.01mol/L 盐酸标准溶