MicroRNA研究概况以及MicroRNA芯片技术简述MicroRNA的研究

MicroRNA研究概况以及MicroRNA芯片技术简述

一、MicroRNA的研究概况

1.MicroRNA

MicroRNA(miRNA，miR)是由约21-25个核苷酸组成的分子，microRNA通过抑制mRNA的翻译或者促进其降解而起到负性调控的作用。最初miRNA的功能在植物学、癌症、病毒性感染和发育生物学中得到了验证。但最近的研究发现，患有心脏疾病的小鼠对照正常状态miRNAs失调，并且在肥大的心脏中也检测到了数种miRNA的上调或者下调，同时体外实验也证实了它们对心肌细胞形态的影响。

2. MicroRNA的研究进展

miRNA现象的最早报道是在1980年的Genetics和Cell上。1993年在线虫中发现的lin-4是第一个被确定的miRNA[31]，它的基因产物是21个核苷酸的RNA分子并且部分序列互补于lin-14 mRNA的3’UTR区域。这些互补序列使lin-4间断地与lin-14 mRNA结

合。奇怪的是，lin-4没有明显地改变lin-14 mRNA的量，但是Lin-14蛋白表达却明显降低。2000年又在线虫中发现了与lin-4相似的miRNA——let-7，它们参与线虫

发育的时空调节。

miRNA基因首先被RNA聚合酶Ⅱ转录为较长的初始转录本，该转录本含有数

千个核苷酸，称其为pri-miRNA。在pri-miRNA内，miRNA位于由大约70个核苷酸

构成的环柄结构内。在动物体内，该环柄结构在细胞核内被RNA酶ⅢDrosha和其辅助

蛋白Pasha/DGCR8识别和切割，形成pre-miRNA。之后，pre-miRNA迅速被核质/细胞质转运蛋白Exportin5转运至细胞质，被位于细胞质内的RNA酶ⅢDicer进一步切割。产生一个类似于siRNA的miRNA：miRNA*复合体，随后，该双链体

解旋为成熟的miRNA和miRNA*，成熟的miRNA在一种ATP-依赖的沉默复合体（RISC）中，形成非对称的RISC复合物。而miRNA*则可能类似于siRNA被Argonaute蛋白处理掉。成熟miRNA通过与特定靶基因mRNA的3’UTR完全或不完全的碱基互补方式引导RISC与目的mRNA结合，从而降解靶mRNA或抑制靶mRNA的翻译（见图1），其中以抑制翻译为主。另外最近发现miRNA与靶mRNA结合后，可使靶mRNA被外切酶降解。

图1 miRNA的形成和功能模式图

miRNA 是一类进化上保守、在生命中起着重要调控作用的分子。多种miRNA在同一个细胞中的表达使得细胞处在一种内在的miRNA 环境中，这个环境控制着成千上万的编码基因的mRNA水平，使得各种蛋白的表达处在一个适合的水平。miRNA 的发现丰富了人们对蛋白质合成控制的认识，补充了在RNA水平对靶mRNA分子进行更迅速和有效的调节，miRNA 的发现也是对中心法则中RNA 次要的中介角色的重要补充。miRNA在基因组中的数量（预计在人类基因中含量>1%，参与至少10%基因的表达调控）和表达水平(一些miRNAs在每个细胞中的拷贝数>1000) ，说明miRNA是一种含量丰富的RNA种类。而且每个miRNA具有调节数百个mRNA的潜能；因此在各类小分子RNA中，miRNA具有最广泛的基因调节功能，它能对基因活动的各个层面进行调节。miRNA的靶基因一般为动植物中发育基因，表明miRNA在控制生物发育方面有不容忽视的作用。miRNA可参与生命过程中的一系列重要进程，包括早期胚胎发育、细胞增殖、细胞凋亡、细胞死亡、脂肪代谢等方面。

随着近年来研究的不断深入，人们开始认识到小RNA分子在真核基因表达调控中有着广泛的作用。目前研究发现miRNA发挥功能的领域有：○1生物个体发育；○2组织分化；○3病毒感染；○4参与癌基因作用。

随着对miRNA研究的不断增加，已经有大量的miRNA为科研工作者们发现。近年来，更是随着生物信息学的不断进步，通过预测发现了更多的miRNA，但是这些预测的结果还

必须要通过实验的验证才能为事实所接受。

目前miRNA的研究领域主要包括miRNA表达谱和miRNA功能分析。由于

miRNA在众多程序的调控，诸如生物发育、细胞增殖、凋亡以及与肿瘤发生相关等领域发挥作用，miRNA的鉴定和定性研究成为迅速发展的一大研究领域。最典型的鉴定miRNAs的方法是检测miRNA的表达谱，如果发现某一种miRNA在某种特定组织或细胞中特异性表达的话，此miRNA将被假定在此特定组织或细胞中发挥某种调控作用。同样，如果某一种miRNA在生物特殊发育阶段表达的话，则它有可能是调控发育进程一个主要分子。miRNA的表达谱可以通过克隆特定组织、细胞或者某个生物体特定发育阶段的miRNA并测序完成，或者通过芯片检测得以完成。克隆和测序miRNA是目前最常用的一种方法，虽然相当费时费力，但却可以发现新的miRNA；而芯片检测虽然是一种高通量的检测方法，但只能检测已知的miRNAs表达水平。

随着成百上千的miRNA被鉴定出来，通过抑制细胞中mRNA的表达水平来研究miRNA的功能迅速发展为一个重要的研究领域。在此期间，miRNA在生理状态下的靶标须待鉴定，因此在探索miRNA功能的过程中运用人工合成的miRNA抑制剂成为一种重要的研究工具。miRNA的活性可以通过对与内源性miRNA互补的磷酰二胺吗啉代反义寡核苷酸（morpholino phosphorodiamidate anti-sense oligonucleotides ）的化学修饰阻断。另外，反义阻断的核苷酸（locked-nucleic acid, LNA）具有更高的结合亲和力，通常被用来抑制人体细胞的miRNA。LNA修饰的探针也用来检测miRNAs的定位和表达方式。

二、MicroRNA芯片技术简述

1. 样品RNA 抽提

a. 实验对象为组织样品，取适量（50-100mg）新鲜组织样品或正确保存的组织样品，冰冻粉碎组织，加1ml的RNA抽提试剂Trizol，匀浆后抽提RNA。

b. 实验对象为细胞样品，每份样品取1×107～1×108细胞，加1ml的RNA抽提试剂Trizol，样品为贴壁细胞，每10cm2培养皿Trizol使用量为1ml，裂解后抽提RNA。

2. RNA 质量检测

a.测定RNA 在分光光度计260nm、280nm和230nm的吸收值，以计算浓度并评估纯度。

b. 用甲醛电泳试剂进行变性琼脂糖凝胶电泳，检测RNA 纯度及完整性。

c. 提供RNA QC报告。

注意：用于芯片检测的RNA 样品，必须是高质量的，完整的，没有RNase污染（降解的样品不能用于标记和芯片检测），没有基因组污染。

3. 制备荧光标记探针

荧光基团标记miRNA,可以得到用于与芯片杂交的荧光探针。

4. 芯片杂交

5. 图像采集和数据分析

扫描芯片的荧光强度，并将实验结果转换成数字型数据保存使用配套软件对原始数据进行分析运算。

6. 提供实验报告