miRNA文献综述 - 图文

须以下列几个原则作为判断标准:（1）能够通过与特定大小的总RNA 样品杂交得到22个碱基对的产物(即需要Northern杂交或引物延伸反应验证表达)。（2）所得的序列是从特定大小的小分子RNA库中克隆到的,并且必需与克隆的来源物种的基因组序列完全匹配。（3）经过前体的二级结构预测, 有发夹状的二级结构, 并且成熟的miRNA序列在发夹的一条臂上。（4）成熟的m iRNA 序列与预测的二级结构在不同物种间有保守性。（5）在Dicer突变的系统中, 前体的积累增多。 miRNA的鉴定方法

鉴定miRNA的主要方法有(1)克隆测序法：先分离纯化小RNA，3’和5’寡核苷酸接头连接进行RT-PCR获得cDNA，连接到载体上构建cDNA文库，筛选克隆进行测序，获得miRNA序列。其优点是操作直接，结果可靠，缺点是很难克隆出在不同时期表达或只在特定组织或细胞系中表达的miRNA；而且由于克隆方法固有的局限性,也很难捕获表达丰度较低的miRNA；该方法受其他小分子（如siRNA）的影响，易产生假阳性。（2）基因芯片技术可以高通量的检测基因表达谱，检测灵敏度较高且可以并行处理，但是其结果是半定量的，重复性较差，不能同时优化所有待测miRNA的杂交环境，因而不能区分高度类似miRNA。（3）Northern杂交：简便可靠，将已知浓度梯度的寡核苷酸参照物与待测样品进行平行杂交，实现对miRNA的半定量检测。既可用于检测miRNA在组织细胞中的表达水平，又可结合RNA marker检测miRNA的分子大小。缺点是对样品的需求量较高，需要微克级样品才能避免假阴性，有时样品量达到40ug才会出现明显杂交信号。（4）

RT-PCR技术：可以简洁、快速、特异、高通量的检测miRNA的相对含量，并可同时检测多种miRNA的表达。需求RNA量少，且不用放射性同位素标记。可以同时检测到成熟miRNA及其对应的pre-miRNA。但是操作中需确保引物3’端的不同，较高的退火温度（60－61℃）可提高反应特异性，以富集的miRNA为模板扩增可提高检测的灵敏性。（5）荧光定量技术：具高度特异性，超宽的定量线性范围和高度的检测灵敏度。适用范围广，总RNA、细胞裂解物及纯化的RNA都可用于miRNA的定量检测，样品消耗少，仅需1～10ng的总RNA。但引物、探针设计要求较高。

miRNA靶基因鉴定：

目前鉴定miRNA靶基因的策略和方法主要有以下几种：正向遗传

学、生物信息学预测、miRNA过表达和基因表达芯片相结合、免疫共沉淀和生物芯片结合、miRNA过表达和蛋白质组学相结合 正向遗传学：

正向遗传学筛查是分子遗传学家最初使用的一种方法,该技术意在鉴定产生特定表型的变异。第一个miRNAlin-46的缺失突变体(e912)首先在Brenner实验室发现，该突变体对线虫发育和分化的影响首先被Horvitz和Sulston确认，lin-4突变体线虫由于不能形成阴户, 导致无法正常产卵, 卵在孵化的同时会吞噬母体导致母体死亡。之后，Ferguson等进一步确认了该突变体的突变基因为lin-4。之后, 哈佛医学院的Ruvkun和Ambros合作, 历经4年时间最终确认了, lin-4并不编码蛋白质而是转录一长度21nt的的非编码RNA。至此历经多年的

不懈研究终于发现了第一个miRNA:lin-4由此可见， 利用正向遗传学研究miRNA的体内作用靶标存在明显的缺陷, 非常耗时费力, 不适合大规模的研究。 生物信息学预测：

利用生物信息学预测miRNA的体内作用靶标并用双色荧光报告系统加以验证是目前比较流行的方法。该方法首先应用于在果蝇中发现的第一个miRNA bantam。与正向遗传学鉴定相比, 生物信息学预测方法在miRNA靶标鉴定方面存在明显的优势:(1)适合于大规模研究特定miRNA的的作用, 可从中选择感兴趣的靶基因加以确认, 这就存在明显的目的性和目标, 极大地加速了靶标鉴定的速度。(2)对靶标的功能归类分析使我们对特定miRNA的功能有整体的概念。但生物信息学预测也存在明显的缺陷:(1)该方法建立在已知的miRNA和靶标相互作用的基础上, 不能预测与已知规则不符的基因。(2)该方法强调miRNA靶位点在进化中的保守性, 不能系统预测miRNA的非保守性靶标。据 估计非保守性靶标的数目是保守性靶标的10倍以上。（3）该方法排除了G:U配对的情况, 导致靶标预测的不完整性。近年的研究发现种子区的G:U配对并不影响miRNA的作用效果(4)该方法仅仅考虑保守性和配对情况, 忽略了靶位点区的二级结构以及蛋白结合因子对miRISC进入的影响, 故不能反映miRNA在体内生理条件下的真实作用情况。以上的缺陷导致生物信息学预测miRNA作用靶标的准确率较低，往往需要大量的验证才能找到miRNA的真正体内作用靶标。 miRNA过表达和基因表达芯片相结合：

在植物中发现的miRNA由于和靶标mRNA完全互补配对, 故植物中miRNA作用靶标的大规模鉴定普遍采用miRNA过表达和基因表达芯片相结合的方法。首先瞬时高表达特定miRNA,然后提取总RNA,利用生物芯片寻找mRNA表达水平下降的候选基因, 之后进行生物信息学分析, 找出表达水平下调的miRNA的3’UTR区与miRNA seed reagion 区互补配对的保守序列。与前面的方法相比，该方法存在明显的优势：在表达水平下调的miRNA中寻找靶基因降低了搜寻的范围, 使得预测更准确、快捷。但该方法也存在缺陷：（1）生物芯片得到的数据无法区别直接相互作用还是间接作用；（2）在哺乳动物中miRNA主要抑制靶基因的翻译, 故该方法只能用于鉴定靶Mrna水平变化的基因;(3)该方法数据的最后分析还是基于已知的miRNA和靶标相互作用的规律, 无法直接得到miRNA的结合位置和系统的结合规律。 免疫共沉淀和生物芯片结合：

近年兴起的免疫共沉淀和生物芯片相结合的方法避免了miRNA过表达和基因表达芯片相结合的方法的缺陷, 可以直接得到和特定miRNA相结合的直接作用靶标。该方法由欧洲分子生物学实验室的Cohen首创。他在果蝇细胞中系统地鉴定了肌肉特异性的miRNA-1的108个靶基因, 其中32个靶基因的3’UTR区存在seed reagion,而其他的靶标却不存在, 这提示miRNA和靶标的相互作用可能存在其他的配对方式, 也可能miRNA发挥作用不仅仅局限于3’UTR。最新的研究表明, 在哺乳动物中miRNA也可靶定基因的编码区进而抑制翻译并促进靶mRNA的降解。该方法的唯一缺陷在于不能确定miRNA的具体结合位点

和结合方式。

miRNA过表达和蛋白质组学相结合：

2008年3月, 美国的研究人员利用基因表达芯片和蛋白质组学相结合的系统鉴定了miR15/16的体内作用靶标, 揭示了miR15/16作为抑癌基因在白血病发生过程中的作用, 系统地阐述了miR15/16的调控网络。他们首先利用基因表达芯片得到了在高表达miR15/16基因簇时表达水平变化的mRNAs, 然后再利用双向电泳和质谱相结合的方法鉴定出蛋白水平发生变化的基因。该方法在miRNA靶标的鉴定方面无疑更直接, 但是, 质谱在鉴定低表达量蛋白方面的缺陷和高耗费, 限制了该方法的应用。