穿膜肽的研究进展

Strait Pharmaceutical Journal Vol 20 No .9 2008

·综述·

摘要: 穿膜肽是一些具有细胞膜穿透能力的小分子多肽, 可有效携带比其分子质量大 100 倍的外源性疏水大分子进入细胞, 并对宿主细胞没有显著

毒副作用。 穿膜肽存在多种穿膜机制, 诸如直接渗透到细胞膜, 通过易位形成的一个暂时性的结构和内吞作用介导入膜等。 具体的穿膜机制还不清楚, 但普遍认为穿膜肽与细胞表面负电荷物质的直接接触是必不可少的。 由于穿膜肽的穿膜性质, 其在分子生物学、药学、细胞生物学、疫苗学甚至影像学上有广泛的应用前景。 本文对近年来穿膜肽的结构、穿膜机制和应用方面的研究进展进行了综述。

穿膜肽的研究进展

熊维德,王 攀 ,张迎庆(湖北工业大学生物工程学院武汉 430068)

＊

关键词:穿膜肽;结构;穿膜机制;应用

中图分类号:R284 文献标识码:A 文章编号:1006-3765(2008)-09-01-04

XIONG Wei-de ,WANG Pan,ZHANG Ying-qing(Bioengineering College,Hubei University of Technology , Wuhan

430068 ,China)

Advance in the research of cell-penetrating peptides

ABSTRACT: Cell-penetrating peptides(CPPs)are some small peptide molecules with cell membrane penetrati-

ing capability ,w hich can effectively bring exogenous hydrophobic macromolecules that are 100-folds larger than its ow n molecular weight into cells and host cells and without any significant side effects.There are multiple trans- membrane mechanisms fo r CPPs ,such as direct penetrating to the cell mem brane , and by translocation to form a temporary structure and the role of endocy tosis to be transmitted into the membrane.Specific membrane-penetrat-ing mechanism is no t clear yet , However , it was well know n that the direct contact of CPPs w ith the negative charge on the surface of cells w as essential.Because of its membrane-penetrating property of CPPs , CPPs have w ide range of applications in molecular biology ,pharmaceuticals ,cell biology ,vaccines and even image study.The recent studies on its structure ,mem brane-penetrating mechanisms and applications w ere review ed in this paper. KEY WORDS :Cell-penetrating peptides;Structure ;M echanisms of membrane-penetrating ;A pplications

mail:yingqingzhang @163.com

由于细胞膜的屏障作用, 多种具有治疗功效的蛋白质、多肽和寡聚核苷酸难以进入细胞发挥药效。 因而如何把有生物活性的物质直接从细胞外导入细胞内, 是一个很有意义的研究课题。 近年来, 一些具有细胞膜穿透能力的小分子多肽(其长度一般不超过 30 个氨基酸)相继被发现, 可有效携带比其分子质量大 100 倍的外源性疏水大分子进入细胞, 并对宿主细胞没有

显著毒副作用。 这些具有细胞穿透功能的多肽, 被 命名为细胞穿膜肽(cell-penetrating peptides, CP Ps)。 1 细胞穿膜肽的结构

目前已经发现及合成的 CP Ps 有数十种, 一类是基于蛋白

转导域的 CPPs(这些多肽多为蛋白与核酸相互作用的区

作者简介:熊维德, 男(1981-)。 在读硕士研究生, 生物化工专业。 联

业。

系电话:13697341739 ;王攀, 女(1984-)。 在读硕士研究生, 生物化工专

通讯作者:张迎庆, 女(1969-)。湖北省黄石市人, 博士, 副教授, 硕士

生导师, 主要从事生物制药研究开发工作, Tel :027 -61230208 , E-

域, 与转录调节有关), 如 T A T 、vp22、penetratin(也称 Antp)和

Pep-1 为例, 包括一个富含疏水性色氨酸基序的片段

Transpo rtan ;还有一类是两性多肽, 它上面既有一个亲水(极性)域,

还有一个疏水性(非极性)域。 如 M PG , P ep-1、M A P 等。 以

(K ET WWET WW T EW), 一个间隔区(SQP), 一个富含亲水性赖氨酸基序的区域(K KK RKV)。 还有一些多肽则不归于上述两类, 如多聚精氨酸等。

无论何种穿膜肽, 对穿膜功能必需的氨基酸残基已经明

〔1〕

确。 如研究较早的 HIV 的转录活化因子-Tat 蛋白(含 86-102 个氨基酸残基), 具有 3 个不同的功能结构域

: 对于反式激活

尤其重要的一个酸性 N-末端区域; 富含半胱氨酸的 DNA 结合区(22-37 位氨基酸), 带有一个锌指基元; 碱性区(第 49- 57 位氨基酸), 参与核转运及蛋白对钙离子非依赖性细胞的附着作用。 研究发现 :全长 86 个氨基酸的 T at 中 49-57 位氨基酸残基组成的序列即可完全行使蛋白转导的功

能。 即具有九个氨基酸序列的线性多肽 Ta t 中(49-57)(arg-ly s-lys-arg-arg-gln-arg-arg-arg), 内含 6 个精氨酸和 2 个赖氨

· 1 ·

海峡药学 2008 年 第 20 卷第 9 期

酸, 这是 T at 蛋白既有穿膜特性又无细胞毒性的最小片段。若任意去除 T at 基本序列中的一个精氨酸残基, 其转运能力会下降 50 %, 去除 2 个精氨酸残基, 则可使 T at 蛋白丧失 75 %的转运活性, 说明富含精氨酸等碱性氨基酸残基可能是其具有穿膜活性的结构基础

〔2〕

而这种机制仍存在疑问, 由于 penetratin 在膜内和膜外不对称

分布, 形成一电场。 随着肽在膜外数目不断增加, 这电场可能导致类似电穿孔的现象

〔15〕

。

第三种穿膜机制是内吞作用介导入膜。 这方面许多研究是

。 对比其他常见穿膜肽, 发现也具有类

通过荧光标记或使用内吞作用抑制剂确认 CPPs 或运转物在细胞的局部。 然而, 实验过程中的人为痕迹对内吞作用研究提供了带有疑问的信息

〔16

似结构。 利用这一特性, 人工合成的多聚精氨酸、赖氨酸, 也具有较强的穿膜活性。 常见穿膜肽氨基酸序列及分类见表 1。

-18〕

。 其他研究显示:penetratin穿膜需

表 1 细胞穿膜肽的分类及氨基酸序列

〔3〕

要能量且通过内吞形式进入;多聚精氨酸先与硫酸乙酰肝素作用, 接着通过内吞作用进入;而 T at 入膜可能是大吞

名称 氨基酸序列基于蛋白转导域的 CPPs

饮作用。 虽然这些研究都显示 CPPs 的穿膜过程都涉及内吞 Tat(49-57) RKKRRQ RRR VP -22 DAATARGRGRSAAS RPT ERPRAPARSAS RPRRPVD ANTP

RQIKIWFQNRRMKWKK

Transportan GWT LNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL 两性多肽 PEP -1 KETWW ETW WTEW SQPKKKRKV M PG GALFLGFLGAAGS TMGAWS QPKKKRKV MAP

KLALKLALKALKAALKLA KALA

WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA ppTG20

GLFRALLRLLRS LW RLLLRA 其他 CPPs Arg9

RRRRRRRRR hC T(9-32) LGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP

2

细胞穿膜肽的穿膜机制

关于 CP Ps 的穿膜机制目前尚无定论, 但 CP Ps 与膜相

互作用中, CPPs 上所带正电荷所起的作用已得到肯定。 它能够与细胞膜中的诸如磷脂类通过静电作用相互结合。 然而, 不同种类的穿膜肽作用形式也不相同。 比如 penetratin 在穿膜过程中首先与细胞表面的负电荷物质相结合, 而 T ranspo rtan 在与膜的相互作用中不依靠电荷〔4〕

。 此外, 比较所有 all-L 和

all-D 的穿膜肽的内部性质

〔5〕

, 发现穿膜过程是一种非受体形

式调控的。 其他研究指出, 细胞表面中的硫酸乙酰肝素发挥重要作用。

通过加入肝素或硫酸化多聚糖或硫酸乙酰肝素缺

陷型细胞株, T at 、penetratin 和 T ransportan 内部结构中有对硫 〔 酸乙酰肝素的降解起抑制作用6

-8〕

。 然而其他研究者宣称,

T at 和 T ransportan 穿膜过程不依赖硫酸乙酰肝素

〔9

,

10〕

。

下面我们讨论穿膜肽的三个主要入膜机制〔11〕

:直接渗透

到细胞膜, 通过易位形成的一个暂时性的结构和内吞作用介导

入膜。

第一种是通过静电作用直接渗透到细胞膜。 如 Tat , 先

是未折叠的融合蛋白与膜表面发生静电作用, 接着直接穿过细胞膜, 在膜内通过分子伴侣系统进行折叠。 然而, 现在这种机制受到质疑, 而代替的是涉及大吞饮作用的穿膜机制

〔1 2〕

和依

〔13〕

靠网格蛋白内吞作用的穿膜机制

。 第二种穿膜机制是通过易位形成的一个暂时性的结构如

penetratin。 在这个模型中

〔14〕

, penetratin 二聚物能与膜上带负

电荷磷脂结合, 从而在脂质双层中形成一个倒转的胶束结构。这种倒转的胶束结构能够保持 penetratin 的亲水性。 然

作用, 但是不同的机制可能是同时发生的

〔19

,

20〕

。

由于 CPPs 及靶细胞种类的不同, CPPs 的穿膜存在多种

不同的机制, 但普遍认为 CPPs 与细胞表面负电荷物质的直接接触是必不可少的。 虽然对于 CPP s 的穿膜机制仍不完全清楚, 但其穿膜特性是肯定的。

3 细胞穿膜肽的应用

与其他生物大分子转运方法相比, 穿膜肽的转导作用具有许多独特之处。 首先, 穿膜肽不仅可以转导多肽和蛋白质,也可以将与穿膜肽偶联的小分子有机化合物、寡核苷酸、 DN A 、噬菌体、脂质体、纳米级的铁珠等多种不同大小的其他物质导人细胞, 并且大部分多肽和蛋白导入后依然保持其生物活性。 其次, 穿膜肽导入的细胞谱广泛, 几乎能将介导的外源分子导入所有的哺乳动物细胞, 甚至包括对 DNA 转染和逆转录病毒感染都不起作用的破骨细胞和外周血单核细胞。第三, 穿膜肽转导以浓度依赖方式进行, 转导效率高, 几乎可以达到 100 %。 另外, 穿膜肽的转导作用迅速, 有文献报道在培养基内加入穿膜肽后 5min 就可以在细胞内检测到。CPP s 的发现为生物大分子用于疾病治疗带来了曙光, 在细胞生物学、基因治疗、药物体内转运临床药效、评价及细胞免疫学等研究领域均具有良好的应用前景。

穿膜肽是能够携带蛋白质穿过血脑屏障的短肽。 利用这一

特性, K illian〔21〕

等通过腹腔注射穿膜肽-β-半乳糖苷酶, 穿膜

肽能携带该融合蛋白到达全身各个组织, 并通过血脑屏障到达脑组织, 同时能保持酶活性, 且研究发现在此过程中对神经细胞及血脑屏障的免疫反应很弱。为寻求通过滴鼻给药这一外周给药方式将大分子蛋白长期、稳定导入脑内的方法, 吴昊

〔22〕

等

构建了一种具有通过血脑屏障功能的信号肽 N T4-GF P-穿膜肽 Ant 融合报告基因, 以绿色荧光蛋白 GFP 基因为大分子蛋白的报告基因, 并设计融合了穿膜肽 Ant 和信号肽 N T 4, 其目的在于利用穿膜肽的蛋白转导功能来介导报告蛋白通过细胞膜和血脑屏障到达靶细胞。

肿瘤细胞与正常细胞虽然在细胞表型有区别, 但它们之间

更大的区别在于细胞内的信号转导途径的差异, 日前有多个小分子药物通过抑制信号传导的药物如 ST I571 进入临床治疗, 已成为肿瘤靶向药物的主力军。 应用穿膜肽可以产生三个方面靶向肿瘤的目的:(1)对于肿瘤特异性激活信号转导途径的关键性转录因子进行失活突变 , 使其能与该关键性转录因子竞争结合

但不产生转录活性, 通过穿膜肽与其融合, 从而关闭该信号转导途径。(2)用穿膜肽导入肿瘤细胞已失活

· 2 ·